丝状真菌基因组改造

1. 丝状真菌菌株介绍及应用

1.1 常见丝状真菌菌株

丝状真菌是一类具有菌丝体的真菌，在自然界中广泛分布，以下是几种常见的具有重要研究和应用价值的丝状真菌菌株：

里氏木霉（Trichoderma reesei ）：是纤维素酶的主要生产宿主，在生物燃料生产和生物质降解领域具有重要作用。

黑曲霉（Aspergillus niger ）：可生产葡糖淀粉酶、果胶酶等多种酶类，占据工业酶市场份额的 50%，同时也是柠檬酸等重要代谢产物的生产菌株。

鲁本斯青霉（Penicillium rubens ）：是生产青霉素的主要工业菌种，经过基因改造后还可用于表达异源基因簇，合成其他天然产物。

米曲霉（Aspergillus oryzae）：在食品工业中广泛应用，可用于发酵生产酱油、酒等，同时也是研究丝状真菌基因表达和代谢调控的模式菌株。

土曲霉（Aspergillus terreus ）：能合成他汀类药物，如洛伐他汀，是降血脂药物的重要来源。

1.2 应用领域

医药领域：丝状真菌可合成多种抗生素（如青霉素、头孢菌素）、免疫抑制剂（如环孢菌素、霉酚酸）、降血脂药物（如他汀类）等，为人类健康提供了重要的药物资源。

工业生产：作为工业酶的主要生产者，其产生的酶类广泛应用于食品、化工、纺织等行业。此外，还可用于生产有机酸（如柠檬酸）、生物燃料等。

农业领域：部分丝状真菌可用于生物防治，抑制植物病原菌的生长；同时，在农业废弃物降解和土壤改良方面也发挥着重要作用。

基础生物学研究：丝状真菌作为模式生物，用于研究基因功能、代谢途径、细胞分化等基础生物学问题，为生命科学研究提供了重要的模型。

2. 丝状真菌基因编辑流程

2.1 靶点设计

（1）确定目标基因：根据研究目的，选择需要编辑的基因，如与次级代谢产物合成相关的基因、耐药基因等。

（2）sgRNA 设计：使用专门的软件（如 E-CRISP、CHOPCHOP、Cas-OFFinder 等）设计针对目标基因的 sgRNA，确保 sgRNA 具有较高的特异性，减少脱靶效应。sgRNA 需要识别原间隔区相邻基序（PAM）位点上游的 20 个核苷酸序列，对于 Cas9 系统，常见的 PAM 序列为 5′-NGG-3′。

2.2 编辑元件准备

（1）Cas9 蛋白表达载体构建：根据丝状真菌的密码子偏好性，优化 Cas9 基因序列，并在其两端添加核定位信号，构建 Cas9 蛋白表达载体。

（2）sgRNA 表达载体构建：sgRNA 的表达需要启动子驱动，常用的启动子有 RNA 聚合酶 Ⅲ 型 U6 启动子、tRNA 启动子、5S rRNA 启动子等。

2.3 编辑元件递送

（1）质粒转化：将构建好的 Cas9 表达载体和 sgRNA 表达载体通过质粒转化的方式导入丝状真菌细胞。常用的转化方法有原生质体转化法、农杆菌介导的转化法等。

（2）自主复制质粒：利用构巢曲霉的 AMA1 序列构建自主复制质粒，该质粒可在丝状真菌染色体外进行自主复制，提高转化效率，并且在非选择性条件下传代培养可去除质粒，实现筛选标记的循环使用。

（3）核糖核蛋白（RNP）复合物递送：将体外转录的 sgRNA 与纯化的 Cas9 蛋白复合为 RNP 复合物，通过显微注射、电穿孔等方法递送至丝状真菌细胞内。RNP 递送方式无需优化表达盒，减少了构建步骤，且 RNP 在体内短暂存在，降低了脱靶风险。

2.4 编辑效率筛选与验证

筛选标记筛选：利用抗生素抗性基因、营养缺陷型基因等筛选标记，筛选出成功导入编辑元件的转化子。

分子生物学验证：通过 PCR、测序等方法对转化子进行验证，检测目标基因是否被正确编辑，如基因敲除、敲入、碱基编辑等。

丝状真菌CRISPR基因组改造策略

3. 丝状真菌基因编辑服务类型

（1）基因敲除服务：针对单个目标基因，设计 sgRNA，利用 CRISPR/Cas9 系统诱导 DNA 双链断裂，通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径实现基因敲除，研究基因功能。

（2）多基因敲除：设计多个 sgRNA，同时对多个基因进行敲除，研究基因之间的相互作用以及代谢途径的调控网络。

（3）基因敲入：通过同源重组（HR）修复途径，将外源基因或特定 DNA 片段插入到目标基因位点，实现基因的敲入。

（4）碱基编辑服务

胞嘧啶碱基编辑（CBE）：利用胞嘧啶碱基编辑器，实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的转换，无需 DNA 双链断裂和供体 DNA。

腺嘌呤碱基编辑（ABE）：通过腺嘌呤碱基编辑器，将腺嘌呤（A）转化为鸟嘌呤（G），实现碱基的精准编辑。

4. 丝状真菌基因编辑技术优势

4.1 高效性

（1）编辑效率高：CRISPR/Cas 系统在丝状真菌中具有较高的编辑效率，单基因编辑效率可达 93% - 100%。

（2）多基因编辑能力：可同时对多个基因进行编辑，实现多基因共敲除、共表达等，便于研究复杂的代谢途径和调控网络。

4.2 精准性

（1）靶向性强：sgRNA 能够精准识别目标基因序列，引导 Cas9 核酸酶在特定位点切割 DNA，实现精准的基因编辑。

（2）HR 修复途径精准编辑：利用同源重组修复途径，可实现基因的精准敲入、替换等操作，编辑精准度高。

4.3 灵活性

（1）多种编辑方式：可实现基因敲除、敲入、碱基编辑、表达调控等多种编辑方式，满足不同的研究需求。

（2）元件可定制：根据不同的丝状真菌物种和研究目的，可定制化设计 sgRNA、选择合适的启动子和递送方式等。

4.4 应用范围广

（1）基础研究：用于研究丝状真菌的基因功能、代谢途径、发育调控等基础生物学问题。

（2）工业应用：可用于改良工业菌株，提高次级代谢产物产量、优化酶的生产等。

（3）药物开发：帮助解析天然产物的生物合成途径，开发新的药物和药物前体。

5. 可编辑的丝状真菌种类及项目周期

6. 交付标准

（1）靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

（2）工程菌株甘油管2支

（3）mRNA转录水平数据（过表达）

（4）项目结题报告

7. 成功案例：黑曲霉 CBS513.88 外源基因定点敲入（基于 5S rRNA 启动子 CRISPR/Cas9）

黑曲霉 CBS513.88 是工业常用底盘菌株，依托5S rRNA 启动子驱动 sgRNA的 CRISPR/Cas9 系统，可高效实现外源基因定点敲入。本案例以内源 5S rRNA 基因作 Pol Ⅲ 启动子，转录效率高、保守性强，无需严格起始碱基，显著优于传统 U6 启动子，基因靶向效率接近 100%。本案例构建含同源臂的供体 DNA（携带外源基因与筛选标记），将线性 5S rRNA-sgRNA、Cas9 表达质粒与供体 DNA 共转化原生质体。Cas9 切割产生双链断裂后，以同源重组完成定点整合，实现外源基因的高效定点敲入。

黑曲霉CBS513.88 外源基因定点敲入转化筛选板

黑曲霉CBS513.88 外源基因敲入鉴定