酿酒酵母基因组改造
1. 酿酒酵母菌株介绍及应用
1.1 菌株特性
（1）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种模式真核微生物，具有以下显著特性：
（2）高效发酵能力：在厌氧条件下能将葡萄糖高效转化为乙醇，是传统酿酒和现代生物燃料生产的核心菌株。
（3）遗传背景清晰：作为最早完成全基因组测序的真核生物之一，其基因功能研究较为透彻。
（4）耐受性强：对乙醇、渗透压等环境压力具有较高耐受性，适合工业规模培养。
（5）操作便捷性：拥有成熟的遗传转化体系，便于进行基因编辑操作。
1.2 应用领域
（1）生物燃料生产：是生产生物乙醇的主要菌种，通过基因编辑优化代谢途径可显著提高乙醇产量和生产效率。如通过编辑 ADH2、GPD1 和 ALD4 基因，使乙醇产量较野生型提高 1.41倍。
（2）食品与酿造工业：用于啤酒、葡萄酒、面包等食品的发酵生产，基因编辑可改良风味物质合成、提升发酵性能。
（3）化学品合成：作为“细胞工厂”生产有机酸、氨基酸、蛋白质等多种化学品。
基础研究模型：广泛应用于细胞周期、信号转导、代谢调控等生命科学基础研究领域。
2. 酿酒酵母基因编辑流程
2.1 CRISPR/Cas9 系统设计
（1）靶点选择：针对目标基因的开放阅读框（ORF）区域，设计特异性 sgRNA（单- guide RNA），通常选择含 PAM（protospacer adjacent motif）序列的区域，确保编辑效率和特异性。
（2）sgRNA 表达 cassette 构建：通过 PCR 扩增 sgRNA 编码序列，构建单个或多个 sgRNA 的表达载体。
2.2 基因编辑载体构建
（1）单基因编辑载体：将单个 sgRNA 表达 cassette 与 Cas9 表达元件整合到合适的质粒载体中。
（2）多基因编辑载体：采用多克隆位点（MCS）设计，通过酶切 - 连接方法将多个 sgRNA 表达 cassette 串联，构建可同时编辑多个基因的载体。
2.3 酵母转化
采用化学转化法（如 LiAc/PEG 法）或电穿孔法将编辑载体导入酿酒酵母细胞，实现外源 DNA 的高效摄取。
2.4 突变株筛选与鉴定
（1）初步筛选：在选择性培养基（如 SD 培养基）上筛选转化子。
（2）分子鉴定：通过 PCR 扩增目标基因区域，结合 Sanger 测序验证基因突变情况，确认基因敲除、敲入或定点突变是否成功
酵母多基因改造策略[1]
3. 酿酒酵母基因编辑服务类型
3.1 单基因编辑服务
（1）基因敲除：针对单个目标基因，设计 sgRNA 并构建编辑载体，实现基因的高效失活，常用于研究基因功能或阻断副产物合成途径。
（2）基因敲入 / 定点突变：在特定基因组位点引入外源基因或进行定点突变，用于基因功能研究或蛋白质工程改造。
3.2 多基因组合编辑服务
（1）双基因编辑：同时对两个基因进行编辑，研究基因间的协同作用，优化代谢网络。
（2）三基因及多基因编辑：实现三个或更多基因的同时编辑，通过组合效应调控复杂代谢途径，提高目标产物产量。
3.3 代谢途径优化定制服务
根据客户需求，针对特定代谢途径设计基因编辑策略，通过多基因组合编辑优化碳流分配，提高目标产物（如乙醇）的产量和生产效率，提供从靶点设计到菌株性能验证的全流程服务。
3.4 定制化菌株构建服务
结合客户的具体应用场景（如工业发酵、化学品生产），提供定制化酿酒酵母菌株的构建服务，包括基因编辑方案设计、载体构建、菌株筛选及性能优化。
4. 技术优势
4.1 编辑效率高
（1）单基因敲除效率可达 80%-100%，双基因和三基因编辑效率分别为 85%-95%，可实现高效的基因组工程操作。
（2）一步转化即可完成多基因编辑，避免多次转化的繁琐操作，大幅提高实验效率。
4.2 多基因编辑能力强
基于 CRISPR/Cas9 系统的多 gRNA 载体构建策略，可实现 1-3 个基因的同时编辑，便于研究基因间的组合效应和调控复杂代谢网络。
4.3 代谢调控效果显著
通过多基因组合编辑，可有效调控碳流分配，减少副产物（如甘油、乙酸）生成，提高目标产物（如乙醇）的产量和生产效率。
4.4 技术通用性好
适用于多种酿酒酵母菌株，包括实验室模式菌株和工业生产菌株，可根据不同需求进行定制化编辑，具有广泛的应用前景。
5. 项目周期
酿酒酵母典型菌株（如Y1H、BY4741/4742）：2-3个月
酿酒酵母野生菌株：定制化项目，需具体评估
6. 交付标准
（1） 靶位点PCR及DNA测序鉴定数据
（2）工程菌株甘油管2支
（3） mRNA转录水平数据（过表达）
（4）项目结题报告
7. 参考文献
[1] Liu K, Yuan X, Liang L, Fang J, Chen Y, He W, Xue T. Using CRISPR/Cas9 for multiplex genome engineering to optimize the ethanol metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Eng J, 2019, 145:120-126.