根瘤菌基因组改造

1. 研究背景

根瘤菌的基因组改造是通过基因编辑技术对其基因组进行操作，以实现特定的生物学功能或表型改变，主要包括以下应用研究：

（1）提高固氮效率：根瘤菌本身能与豆科植物共生固氮，但天然菌株的固氮能力可能存在一定局限。通过工程改造，可优化其固氮相关基因的表达调控，增强固氮酶的活性等，使根瘤菌为植物提供更多的可利用氮素，减少化学氮肥的施用，促进植物更好地生长。

（2）增强环境适应性：使其能在更广泛的土壤环境条件下存活、定殖并发挥作用，比如改造后能适应不同的酸碱度、温度、湿度以及土壤微生物群落构成等情况，利于其在不同地区的农田等环境中与豆科植物成功共生。

（3）扩大宿主范围：天然根瘤菌往往只能与特定的几种豆科植物形成共生关系，改造工程菌株有望打破这种限制，使其能与更多种类的豆科植物共生结瘤固氮，从而增加可受益的植物种类，提升生态系统中氮素循环利用的效率。

2. 基因编辑技术

利用 CRISPR-Cas 及Tn5转座酶系统等先进的基因编辑工具，精准地对根瘤菌的基因组进行编辑。比如敲除影响固氮效率的负调控基因，或者插入外源的相关基因，实现对其遗传信息的定向改造，以获得期望的优良性状。

CRISPR/Cas9切割及Tn5转座原理图

3. 服务类型

（1）无标记基因敲除：利用CRISPR-Cas9基因编辑系统实现高效定点敲除，并消除外源质粒；

（2）无痕基因点突变：利用CRISPR-Cas9系统的高效定点切割优势，实现基因组定点突变；

（3）无痕基因敲入：利用CRISPR-Cas9或Tn5基因编辑系统实现基因组定点敲入；

（4）基因过表达：利用CRISPR-Cas9或Tn5基因编辑系统实现基因组特定位点的基因过表达；

（5）基因大片段缺失：利用Red/ET重组系统和CRISPR-Cas9基因编辑系统结合，实现基因组特定区域的大片段基因缺失。

4. 技术优势

（1）高效定点切割：利用传统的λRed 同源重组技术与先进的CRISPR-Cas9 无痕编辑系统结合，高效切割后的同源修补机制与同时进行多位点编辑效果协同。对单位点的基因编辑效率可达 90%以上；

（2）基因快速整合：对于目的基因的插入或者过表达通过Tn5转座酶系统快速实现；

（3）无痕编辑：靶位点编辑后不留任何抗性或重组位点，同时消除外源质粒；

（4）操作简单：构建好 CRISPR 编辑质粒后通过电转的方法导入至目标菌体内进行基因编辑；

（5）靶向性强：CRISPR 技术具有靶向性强、脱靶率低等优势，可实现对目标位点的精准编辑。

5. 项目周期

2-3个月

6. 交付标准

（1）靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

（2）工程菌株甘油管2支

（3）mRNA转录水平数据（过表达）

（4）项目结题报告

7. 成功案例：基于Tn5转座酶系统实现慢生根瘤菌的荧光标记

转座酶（Transposase）是一类在转座子（可移动的 DNA 序列）转移过程中发挥关键作用的酶，能实现外源基因的高效随机插入，适用于目标基因的过表达及荧光标记等。通过构建红色荧光mScarlet3与抗性基因融合，然后通过制备 Tn5 Transposome RNP Complex，经电穿孔导入大肠杆菌和慢生根瘤菌，成功实现荧光标记。