慢病毒包装（LV）
1. 概念
慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科，因其感染后具有较长潜伏期而得名。在基因工程领域，慢病毒载体系统是以HIV-1（人类免疫缺陷病毒1型）为基础，经过多代安全性改造而开发的基因递送工具。现代慢病毒载体已去除所有致病相关基因，仅保留病毒复制、包装和转导所必需的顺式作用元件，成为安全、高效的基因治疗和功能基因组学研究平台。
2. 载体组成
常规慢病毒还是以三质粒系统为主，而在部分高安全性或高效率要求的场景中，采用四质粒系统。四质粒系统在三质粒基础上将包装质粒拆分为两个独立质粒，进一步降低重组产生复制型慢病毒的风险，并可独立优化各组分表达量，提升病毒包装滴度。
2.1 三质粒系统
2.1.1 转移载体（Transfer Vector）
• 5'长末端重复序列（5'LTR）
• Ψ包装信号序列
• 目的基因表达框（启动子-目的基因-polyA）
• 中央多聚嘌呤束（cPPT）和WPRE增强元件
• 3'自我失活长末端重复序列（3'ΔLTR）
2.1.2 包装质粒（Packaging Plasmid）
• gag基因：编码病毒结构蛋白（MA、CA、NC等）
• pol基因：编码逆转录酶、整合酶、蛋白酶
2.1.3 包膜质粒（Envelope Plasmid）
• 通常使用VSV-G（水疱性口炎病毒G蛋白）假型包膜
• 赋予病毒广泛的宿主嗜性
2.2 四质粒系统
2.2.1 转移载体（Transfer Vector）
• 携带目的基因表达框（启动子-目的基因-polyA）
• 含 5’LTR、Ψ包装信号、cPPT、WPRE 及 3’∆LTR 等顺式作用元件
2.2.2 gag/pol 包装质粒（Packaging Plasmid）
• 编码 gag 基因（MA、CA、NC 等结构蛋白）和 pol 基因（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）
• 已删除 env、vpr 等附属基因，最大限度降低重组风险
2.2.3 Rev 辅助质粒（Rev Plasmid）
• 编码Rev蛋白，负责识别病毒RNA上的RRE（Rev应答元件），介导未剪接gag/pol mRNA的核输出
• 与gag/pol质粒分离，使两者在无Rev时均无法单独产生感染性颗粒，安全性进一步提升
2.2.4 囊膜质粒（Envelope Plasmid）
• 通常采用VSV-G假型包膜，赋予病毒广泛的宿主嗜性；也可替换为靶向特定细胞类型的囊膜蛋白
• 与其他三个质粒完全独立，囊膜基因序列与病毒基因组无同源区，从根本上杜绝重组产生野生型病毒的可能
图1. 三质粒和四质粒包装系统是示意图
2.3 三质粒系统与四质粒系统的其它比较
• 安全性：四质粒系统将 Rev 从 gag/pol 质粒中独立拆出，任意两个质粒之间均无法产生完整的复制型慢病毒（RCL），安全等级更高，尤其适合临床级别（GMP）生产
• 滴度：Rev质粒独立后可单独优化其启动子强度与拷贝数，gag/pol表达量不再受 Rev共质粒约束，包装滴度通常提升2–5倍
• 灵活性：各质粒可独立替换或优化，例如更换囊膜蛋白实现细胞靶向、替换转移载体携带不同目的基因，无需重新构建整套系统
• 适用场景：三质粒系统操作简便，适合常规科研用途；四质粒系统更适合高滴度制备、临床前/临床级生产以及对RCL零容忍的项目（如CAR-T细胞治疗、造血干细胞基因治疗）
3. 核心技术与优势
3.1 感染分裂与非分裂细胞
慢病毒载体最显著的优势在于其能够转导处于细胞周期任何阶段的细胞，包括终末分化的非分裂细胞。这一特性源于慢病毒前整合复合体具有主动核转运能力，无需等待核膜解体即可进入细胞核。应用场景：
• 神经科学研究：可直接转导成熟神经元、星形胶质细胞
• 心血管研究：转导心肌细胞、血管内皮细胞
• 肝脏研究：转导肝细胞、肝星状细胞
• 免疫学研究：转导巨噬细胞、树突状细胞等抗原呈递细胞
3.2 基因组整合与长期稳定表达
慢病毒整合酶识别病毒DNA末端的att序列，在宿主基因组上产生交错切口，将病毒DNA共价连接到宿主染色体。整合位点相对随机，但倾向于转录活跃区域和基因内部。整合后的前病毒DNA成为宿主基因组的一部分，随染色体复制传递给子代细胞，表达可持续数月至数年，甚至终生。应用场景：
• 稳定细胞系构建：药物筛选、蛋白生产、报告基因细胞系
• 长期基因功能研究：慢性疾病模型、发育生物学研究
• 细胞治疗：CAR-T细胞、造血干细胞基因治疗
• 动物模型：转基因动物、疾病模型建立
3.3 较大的包装容量
慢病毒载体的有效包装容量为8-10kb，可满足大多数基因治疗和功能研究需求。应用场景：
• 全长cDNA表达
• 多顺反子表达系统
• 复杂调控元件（组织特异性启动子、增强子）
• 双基因或多基因共表达
• CRISPR/Cas9系统（sgRNA + Cas9）
4. 舒桐服务
舒桐科技凭借多年的慢病毒研究经验，为启动子调控、靶基因过表达、基因沉默等研究提供便捷高效的服务。可以提供从慢病毒质粒构建至病毒包装的所有服务外包项目。我们的慢病毒包装服务可以节省您构建慢病毒载体、包装病毒的宝贵时间和精力，使您可以获得即用型慢病毒颗粒，加速研究进展。
服务类型 | 规格 | 目录价 | 货期 |
小包装、CRISPR/Cas9 | 滴度≥1×10E8 TU/ml；体积1ml | 欢迎询价 | 2-3周 |
大包装、CRISPR/Cas9 | 滴度≥1×10E8 TU/ml；体积1ml | 欢迎询价 | 2-3周 |
shRNA干扰慢病毒 | 滴度≥1×10E8 TU/ml；体积1ml | 欢迎询价 | 2-3周 |
shRNA(3保1)干扰慢病毒 | 滴度≥1×10E8 TU/ml；体积1ml | 欢迎询价 | 2-3周 |
过表达慢病毒 | 滴度≥1×10E8 TU/ml；体积1ml | 欢迎询价 | 2-3周 |
4.1 服务特色
• 载体全：多种表达载体、多种标签载体和多种报告基因可供客户选择；
• 货期短：Human ORF cDNA克隆和Human microRNA克隆可在2-3天穿梭至慢病毒载体，个性化定做慢病毒；
• 服务优：根据客户具体实验，由公司专业技术人员提供载体构建方案，提供特殊定制服务；
• 效果稳定：通过qPCR绝对定量测定病毒滴度，并在工具细胞293T中进行感染验证，确保病毒效果。
图2. 慢病毒感染细胞效果图
4.2 常见问题解答
Q1、什么情况下选用慢病毒？
慢病毒的宿主范围比较广，既能感染分裂细胞，也能感染非分裂的细胞，在体内外研究中均可选择慢病毒作为病毒载体。此外，慢病毒也是构建稳转株的理想病毒。
Q2、慢病毒载体可插入多大的 ORF 片段？
一般情况下，慢病毒载体可容纳8 kb插入片段。然而，插入的ORF基因大于4 kb时会大大降低病毒的包装效率，进而影响病毒滴度甚至基因表达。
Q3、用于慢病毒感染的细胞接种量是多少？
将状态良好的目的细胞接种到24孔板，细胞浓度一般为1×105/mL细胞，接种细胞数量需要考虑到细胞活力因素、状态因素、生长快慢因素、分裂因素等，一般是保证病毒感染时细胞汇合率达到50%-70%为佳。
Q4、什么是 MOI ？
MOI （multiplicity of infection），即感染复数，指的是感染时病毒与细胞数量的比值。一般认为MOI是一个比值，没有单位。
Q5、慢病毒是否能够稳定表达基因？
是的。慢病毒能将外源基因整合到宿主基因组中，不会随着细胞分裂传代而丢失，因此能实现外源基因的长期稳定表达。
Q6、慢病毒的包装周期是多久？
如果客户提供构建好的慢病毒载体，那么包装时间一般为2-3周左右，若包含前期载体构建等时间，时间大概在4-5周左右。
Q7、慢病毒感染细胞后，目的基因的表达什么时间达到峰值？
慢病毒感染目的细胞后，一般情况下，在72-96h目的基因的表达能达到峰值，但是对于一些特殊细胞、如增殖传代比较慢的细胞，蛋白表达达到峰值则需要更长的时间。
Q8、怎样提高慢病毒的感染效率？
细胞良好的生长状态和感染时适合的 MOI 值是达到高感染效率的保证。一般可以通过提高感染时的 MOI 值来提高病毒的感染效率，必要时可在感染时加入助感染试来提高慢病毒的感染效率。
Q9、慢病毒感染后，细胞状态很差，甚至出现死亡，为什么？
慢病毒会对细胞造成一定的毒性，不同细胞对毒性的耐受力不同。建议调整并降低感染时使用的MOI值，即可在细胞准备时增加铺板细胞的汇合率（可提高至 70%），调整感染时加入的病毒量。此外，还可选择在感染4小时后换液，用新鲜的完全培养液继续培养观察。