白色念珠菌基因组改造

1. 菌株介绍及应用

白色念珠菌（Candida albicans）是一种广泛存在的机会性真菌病原体。在人体健康方面，它可引发从浅表黏膜感染到严重系统性念珠菌病等多种疾病。系统性念珠菌病往往与高发病率和死亡率相关，给临床治疗带来巨大挑战。在科研领域，白色念珠菌是研究真菌生物学、致病机制、宿主 - 病原体相互作用的重要模式生物。通过对其基因功能的研究，有助于理解真菌的生长、繁殖、形态转换以及耐药机制等关键生物学过程，为开发更有效的抗真菌药物和治疗方法提供理论依据。

2. 基因编辑流程

（1）靶点设计：运用专业生物信息学工具，如Design and Analyze Guides tool，根据白色念珠菌的基因组序列（如SC5314 菌株的 CA22 基因组），确定合适的 20bp gRNA 靶点序列，并确保靶点附近存在合适的 PAM（如 NGG）。

（2）gRNA 表达盒制备：克隆 - 无拼接 PCR 组装和单寡核苷酸环化聚合酶延伸克隆（soCPEC）。通过 60 - mer gRNA 寡核苷酸引入 20 - mer gRNA 靶序列，可在一天内完成组装和转化。

（3）供体 DNA 准备：对于基因删除或小修饰，使用退火的互补寡核苷酸合成 dDNA 片段，长度一般限制在 100nt 以内，其上下游分别包含约 50bp 与靶基因侧翼的同源序列。对于基因回补等较大片段整合，则推荐使用 PCR 扩增片段，包含约 500bp 的上下游侧翼同源序列。

（4）转化与筛选：将 CRISPR 组件（Cas9 和 gRNA 表达盒）与线性 dDNA 片段通过锂醋酸盐法共转化到白色念珠菌中，利用 nourseothricin 筛选稳定转化子。之后，根据不同的系统，通过在特定培养基上筛选，实现 CRISPR 组件和标记的去除。

白色念珠菌CRISPR基因组改造策略[1]

3. 服务类型

（1）基因敲除服务：可实现单基因或多基因敲除，针对目标基因设计特异性 gRNA 和 dDNA，高效删除基因，为研究基因功能提供基础。

（2）基因回补服务：利用 CRISPR - 介导的基因回补方法，在突变菌株中精准地将野生型基因重新整合到其原生位点，有效避免传统方法中拷贝数和位置效应的影响，确保准确评估基因功能。

（3）定制化基因编辑服务：根据客户特定需求，如引入点突变、SNP 交换或构建特定基因组合的突变菌株等，提供个性化的基因编辑方案。

4. 技术优势

（1）高效性：多种基因编辑实验显示，无论是使用克隆的 gRNA 盒还是拼接的 gRNA 盒，均能实现高频率的基因编辑。单基因敲除效率可达 70% 以上，双基因同时敲除虽效率稍低（20%），但仍适用于低 - 中通量应用，显著缩短实验周期。

（2）无标记编辑：编辑后的菌株基因组中不会留下永久性标记，避免了标记基因对菌株生理功能的潜在影响，使得研究结果更加准确可靠，且编辑后的菌株可直接用于后续实验，无需额外处理。

（3）快速便捷：优化的 gRNA 生成方法无需分子克隆，实验流程得到极大简化，从准备试剂到完成转化可在一天内完成，相比传统方法大幅缩短了实验时间。

（4）兼容性好：CRISPR 质粒系统能够兼容各种常用的白色念珠菌菌株，为不同研究背景的用户提供了多样化选择。

（5）标准化流程：整个基因编辑流程具有标准化的操作方案，减少了因实验条件差异导致的结果不稳定问题，确保在不同实验室环境下都能获得可靠的实验结果。

5. 项目周期

白色念珠菌标准菌株：3-4个月

白色念珠菌野生菌株：定制化项目，需具体评估

6. 交付标准

（1）靶位点PCR及DNA测序鉴定数据

（2）工程菌株甘油管2支

（3）mRNA转录水平数据（过表达）

（4）项目结题报告

7. 参考文献

[1] Nguyen N , Quail A M M F , Herndaya B A D .An Efficient, Rapid, and Recyclable System for CRISPR-Mediated Genome Editing in Candida albicans[J].Msphere, 2017, 2(2):e00149-17.DOI:10.1128/mSphereDirect.00149-17.