单细胞VDJ测序

单细胞VDJ测序

1. 背景介绍

免疫组库（Immune Repertoire）是指个体在特定时间点体内所有T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的总和，反映了机体的免疫状态和免疫应答能力。TCR和BCR通过V(D)J基因重排产生高度多样性的抗原识别序列，是适应性免疫系统识别和清除病原体、肿瘤细胞的分子基础。深入解析免疫组库的组成、多样性和克隆动态，对于理解免疫应答机制、评估免疫治疗效果具有重要意义^[1,2]。

在细胞治疗领域，单细胞免疫组库测序技术具有独特价值。对于CAR-T细胞产品，可以监测内源性TCR克隆组成和多样性变化；对于TCR-T细胞产品，可以验证外源TCR的表达和配对准确性；对于TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）疗法，可以追踪肿瘤反应性T细胞克隆的扩增和持久性^[3,4]。单细胞VDJ测序的优势在于能够获取完整的TCR α/β链或BCR重/轻链配对信息，克服传统bulk测序无法确定链配对的局限。

舒桐科技建立了完善的单细胞免疫组库（TCR/BCR）测序分析平台，支持从样本处理、单细胞VDJ建库测序到专业生物信息学分析的全流程服务，为免疫学研究和细胞治疗产品开发提供高质量的免疫组库数据和深度分析支持。

2. 单细胞免疫组库测序检测原理

单细胞免疫组库测序（single-cell VDJ sequencing）的核心原理是在单细胞水平捕获和测序TCR或BCR的全长可变区序列，同时获取同一细胞的转录组信息。通过将每个细胞标记独特的分子条码，可以确定来自同一细胞的α/β链（TCR）或重/轻链（BCR）配对关系，重建完整的抗原受体序列。

技术流程包括：首先使用10x Genomics等单细胞平台将单个免疫细胞封装于含有细胞条码的凝胶微珠液滴中，进行细胞裂解和mRNA捕获；随后通过逆转录和模板转换反应在cDNA末端添加通用序列；利用针对TCR/BCR恒定区的特异性引物进行富集扩增，同时保留5'端转录组信息；经过文库构建和高通量测序后，通过专业生物信息学分析流程进行VDJ序列组装、克隆型鉴定、配对分析和多样性评估。

图1 单细胞免疫组库（TCR/BCR）测序技术流程示意图

3. 单细胞免疫组库测序技术创新与优势

3.1 核心技术创新

3.1.1 完整链配对信息获取

克服传统bulk测序局限，实现精确的受体链配对分析：

（1）单细胞水平确定TCR α/β链或BCR重/轻链的天然配对关系；

（2）获取完整的V(D)J重排序列，包括CDR3区和框架区；

（3）支持TCR-T产品的外源TCR表达验证和配对准确性分析。

3.1.2 多模态联合分析

整合免疫组库与转录组/蛋白组信息，实现深度免疫表征：

（1）同一细胞同时获取VDJ序列和基因表达谱；

（2）支持与CITE-seq（蛋白表达）联合分析；

（3）关联克隆型与细胞表型、功能状态和分化轨迹。

3.1.3 克隆追踪与动态监测

支持纵向研究，追踪免疫克隆的动态变化：

（1）识别和追踪特定抗原反应性克隆的扩增和收缩；

（2）评估治疗前后免疫组库多样性和组成变化；

（3）监测CAR-T/TCR-T产品回输后的克隆动态和持久性。

3.1.4 抗原特异性预测

基于序列特征预测TCR/BCR的抗原特异性：

（1）与已知抗原特异性TCR/BCR数据库比对注释；

（2）基于机器学习方法预测潜在的抗原靶点；

（3）识别肿瘤新抗原反应性T细胞克隆。

3.2 方法学验证与性能指标

舒桐科技对单细胞免疫组库测序平台进行了全面系统验证，确保数据质量和分析准确性：

4. 应用场景与服务优势

4.1 应用场景

单细胞免疫组库测序技术在多个领域具有广泛应用：

（1）CAR-T/TCR-T细胞产品质量评估：分析内源性TCR克隆组成，验证外源TCR表达和配对；

（2）TIL疗法研究：识别和追踪肿瘤反应性T细胞克隆，评估TIL多样性和功能状态；

（3）免疫检查点抑制剂疗效评估：监测治疗前后T细胞克隆扩增和免疫组库动态变化；

（4）疫苗和抗体开发：解析疫苗诱导的B细胞应答，筛选高亲和力抗体序列；

（5）自身免疫病研究：识别自身反应性T/B细胞克隆，解析疾病发病机制；

（6）感染免疫研究：追踪病原体特异性免疫应答和记忆细胞形成。

4.2 服务优势

（1）完整解决方案：提供从样本处理、VDJ建库测序到专业分析的一站式服务；

（2）多模态整合：支持VDJ与转录组、蛋白组联合分析，提供全面免疫表征；

（3）认证质量管理：实验室同时运行ISO9001与CNAS质量管理体系；

（4）专业分析团队：具备丰富的免疫组库数据分析和细胞治疗研究经验；

（5）定制化服务：支持抗原特异性分析、克隆追踪等个性化分析需求。

5. 单细胞免疫组库测序示例报告

舒桐科技提供全面的单细胞免疫组库测序分析报告，包含测序数据质量评估、VDJ检出统计等基础信息。

图2是生信分析流程图：VDJ-seq 数据分析包含三个核心步骤：首先对原始 FASTQ 数据进行质量控制和预处理，去除低质量序列和种系序列；然后利用唯一分子标识符（UMI）进行序列去重，生成共有序列以消除 PCR 扩增偏差；最后使用 IgBlast 进行 V(D)J 基因片段注释和 CDR3 识别，组装免疫球蛋白克隆型并输出标准化结果文件，确保分析的准确性和可重复性。

图2 单细胞转录组（VDJ）分析流程示意图

报告核心内容包括：

（1）VDJ序列组装与注释分析：统计每个样本的VDJ检出率、productive序列比例、链配对率等质量指标，提供V/D/J基因使用频率分析和CDR3长度分布。

图3 VDJ基因使用频率与CDR3长度分布图

（2）克隆型鉴定与频率分析：基于CDR3序列进行克隆型定义，统计各克隆型的细胞数量和频率，识别优势克隆和稀有克隆，绘制克隆型频率分布图。

图4 克隆型频率分布与Top克隆展示图

（3）免疫组库多样性分析：计算Shannon多样性指数、Simpson指数、Clonality等标准多样性指标，评估免疫组库的丰富度和均匀度。

图5 免疫组库多样性指数统计图

（4）链配对与受体重建分析：展示TCR α/β链或BCR重/轻链的配对关系，重建完整的抗原受体序列，支持后续功能验证实验。

图6 TCR/BCR链配对Sankey图分析

（5）克隆共享与差异分析：比较不同样本或不同时间点之间的克隆型共享和差异，追踪特定克隆的动态变化，评估免疫应答特异性。

图7 样本间克隆共享Venn图与追踪分析

（6）VDJ-转录组联合分析：整合VDJ序列与转录组数据，关联克隆型与细胞表型、功能状态，识别具有特定表型特征的克隆亚群。

图8 VDJ-转录组联合UMAP聚类分析图

6. 单细胞免疫组库测序服务内容

7. 样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准；②T/B细胞比例较低时建议进行细胞分选富集；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

8. 参考文献

[1] Peter Chovanec. (2018). Unbiased quantification of immunoglobulin diversity at the DNA level with VDJ-seq. Nat Med, VOL.13 NO.6.

[2] Georgiou G, et al. (2014). The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nat Biotechnol, 32(2):158-168.

[3] Yost KE, et al. (2019). Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med, 25(8):1251-1259.

[4] Zheng C, et al. (2021). Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell, 169(7):1342-1356.