枯草芽孢杆菌基因编辑

枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 基因编辑服务

1. 研究背景

枯草芽孢杆菌是一种极其重要的工业微生物，被美国 FDA 评定为 GRAS（一般认为安全） 级别。其强大的蛋白分泌能力、清晰的遗传背景及优异的生长特性，使其在工业酶制剂、生物医药及代谢工程领域占据核心地位 。精准高效的基因编辑技术是优化其生产性能、构建高效细胞工厂的关键工具 。

在此背景下，舒桐生物推出 CRISPR/Cas9 方法进行枯草芽孢杆菌的基因组改造，可在不同菌株中定制化实现目标基因的敲除、大片段缺失、点突变、基因整合（过表达）等服务，交付阳性突变株 。我们致力于为全球科研与工业客户提供专业、可靠的定制化枯草芽孢杆菌基因编辑解决方案 。

2. 菌种特性与生物学背景

（1）革兰氏染色属性：枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌（Gram-positive）。

（2）物理特征：拥有一层厚实的肽聚糖细胞壁（约 20-80nm），且缺乏革兰氏阴性菌的外膜结构 。其显著特征是在生长后期能形成极具抗逆性的芽孢 。

（3）工业意义：作为模式革兰氏阳性菌，它是研究蛋白质分泌机制、细胞分化及生物膜形成的理想模型 。在工业上广泛用于分泌表达各种水解酶、抗生素及维生素 。

（4）遗传转化：具有天然转化能力（Natural Competence），但在特定环境下（如工业菌株）仍需优化转化效率以实现高效编辑 。

图1 枯草芽孢杆菌在培养基平皿中的生长情况

3. 文献报道的编辑策略

针对枯草芽孢杆菌厚重细胞壁带来的转化难题，目前主流文献及科研实践中采用的编辑策略包括：

3.1 CRISPR/Cas9 系统（主流方案）：

（1）原理：利用 Cas9 蛋白（含 RuvC 和 HNH 结构域）在 sgRNA 的引导下对目标基因组 DNA 进行位点特异性切割。

（2）优势：通过双链断裂（DSB）诱导修复，可实现高效的基因敲除、大片段缺失或基因整合（过表达）。

3.2 同源重组（Homologous Recombination）：

常配合等位基因交换质粒使用，利用枯草芽孢杆菌强大的内源重组系统实现精准编辑 。

转化效率优化：针对工业生产菌株（如 WB600 或高产酶株），通过优化培养条件诱导天然转化力，或采用电转化技术克服厚细胞壁导致的转化屏障 。

4. 核心应用领域

（1）功能基因组学：精准删除代谢通路关键基因，研究其对生长、成孢或蛋白分泌的影响 。

（2）细胞工厂构建：通过点突变或基因敲除，削弱副产物合成，提升目标蛋白或代谢物的产量。

（3）合成生物学改造：在基因组中整合强启动子或报告基因，构建智能传感菌株或高效表达系统 。

（4）底盘细胞精简：进行大片段缺失，去除不必要的代谢负担基因（如原噬菌体序列），构建稳定性更高的工业菌株。

5. 项目流程与验证

我们提供从设计到交付的一站式服务，确保编辑结果的准确性：

（1）方案设计与载体构建：针对目标靶点设计敲除载体。

（2）细菌转化与筛选：利用天然转化或电转化技术导入编辑系统。

（3）多重验证：通过PCR鉴定、Sanger测序确保阳性突变。

图2 项目流程示意图

6. 基因编辑项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）基因敲除/失活：精准删除蛋白酶基因或代谢副产物基因，优化底盘性能。

（2）基因敲入/过表达：在特定位点整合外源表达框或增强内源限速酶表达 。

（3）点突变/修饰：对关键酶进行定点突变，提升热稳定性或催化活性 。

（4）多基因编辑：连续编辑多个基因，构建复杂的代谢网络改造菌株 。

6.2 技术优势：

（1）高成功率：拥有丰富的工业菌株及实验室模型株编辑经验 。

（2）定制化设计：根据生产目标（如提升酶活、改善生长等）设计最优编辑策略 。

（3）全程验证：提供从方案到最终基因型确认的完整闭环报告 。

7. 案例介绍

我们已成功为国内外多家顶尖高校、研究机构及生物技术公司提供服务，以下为部分示例：

案例：枯草芽孢杆菌BS168突变菌株构建

项目内容：成功敲除了BS168基因组中的靶基因序列

图3 单克隆鉴定靶基因敲除情况

图4 测序显示已将靶基因成功敲除

8. 参考文献

[1] Zhu, B., et al. (2020). Engineering Bacillus subtilis as a versatile cell factory. Current Opinion in Biotechnology.

[2] Bruckner, R. (1997). Gene replacement in Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. Methods in Molecular Biology.

[3] Jiang, W., et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology.

[4] Altenbuchner, J. (2016). Editing the Bacillus subtilis genome by cotransformation of a CRISPR-Cas9 system. Applied and Environmental Microbiology.

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