拟杆菌基因编辑

拟杆菌 (Bacteroides) 基因编辑服务

1. 研究背景

拟杆菌是人类肠道菌群中丰度最高、最具代表性的专性厌氧革兰氏阴性菌。其在多糖代谢、调节宿主免疫系统及定植抗性中发挥着至关重要的作用。随着对“微生物-肠-脑轴”及共生机制研究的深入，精准高效的基因编辑技术已成为解析拟杆菌功能基因、开发工程益生菌及治疗策略的核心工具 。

在此背景下，舒桐生物推出针对拟杆菌的 CRISPR/Cas 及自杀质粒同源重组方案，可在不同种类的拟杆菌（如多形拟杆菌 B. thetaiotaomicron、脆弱拟杆菌 B. fragilis 等）中定制化实现目标基因的敲除、点突变、基因整合（过表达）等服务，交付确认的阳性突变株 。我们致力于为全球科研客户提供专业、可靠的拟杆菌基因组改造解决方案。

2. 菌种特性与生物学背景

（1）革兰氏染色属性：拟杆菌属于典型的革兰氏阴性菌 (Gram-negative)。

（2）物理特征：专性厌氧，不产芽孢，具有复杂的荚膜多糖结构。其外膜结构含有独特的脂多糖（LPS），与常见的肠道致病菌有所不同 。

（3）临床与生态意义：它们是肠道内主要的碳水化合物降解者。虽然大多为共生菌，但脆弱拟杆菌等在腹腔感染中也具有重要的临床意义 。

（4）代谢与应用：具有极强的多糖利用能力（PULs 基因簇），是研究肠道共生机制、复杂碳源代谢及宿主-微生物互作的理想模型 。

图1 拟杆菌厌氧培养基平皿中的生长情况

3. 文献报道的编辑策略

针对拟杆菌专性厌氧及常规转化效率较低的挑战，目前主流文献采用的策略包括：

3.1 CRISPR/Cas 系统 (如 Cas9 或 Cas12a)：

（1）原理：利用 Cas 蛋白在 sgRNA 引导下对目标基因组进行精准切割 。

（2）优势：作为强有力的反向筛选工具，极大地提高了无痕编辑的效率，尤其适用于大片段缺失或基因整合 。

3.2 反向筛选系统 (Counter-selection)：

常利用包含 tdk 基因的自杀质粒，结合 5-氟脱氧尿嘧啶 (FUdR) 进行反向筛选，实现精准的染色体置换 。

3.3 接合转移 (Conjugation)：

针对拟杆菌电转化效率不稳定的难题，通常利用大肠杆菌（如 S17-1）作为供体菌，通过接合转移高效地将编辑质粒导入受体拟杆菌 。

3.4 转化效率优化：

针对不同种属的拟杆菌，优化接合时间、供受体比例及培养基组分，克服厚荚膜导致的进入障碍。

4. 核心应用领域

（1）功能基因组学：精准删除多糖利用位点 (PULs)，研究其在复杂肠道环境中的竞争优势 。

（2）宿主-微生物互作：通过敲除毒力因子或表面多糖合成基因，解析其对肠道免疫系统的调节机制 。

（3）合成生物学底盘构建：在基因组安全位点插入治疗性蛋白表达框，开发新型“活菌药物”递送系统 。

（4）代谢途径改造：通过基因过表达或点突变，优化短链脂肪酸 (SCFAs) 的合成路径 。

5. 项目流程与验证

我们提供从设计到交付的一站式服务，确保编辑结果的准确性：

（1）方案设计与载体构建：针对拟杆菌靶位点设计敲除质粒。

（2）细菌转化与筛选：克服专性厌氧菌转化难点，筛选整合克隆。

（3）二次重组与回复：通过反向筛选或 CRISPR 切割诱导二次重组 。

（4）多重验证：通过PCR鉴定、Sanger测序确保阳性突变。

图2 项目流程示意图

6. 基因编辑项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）基因敲除/失活：精准删除特定代谢或信号通路基因，用于研究基因功能 。

（2）基因敲入/过表达：在染色体位点整合报告基因（如荧光蛋白）或功能基因 。

（3）无痕编辑：不引入抗性标记，支持对同一菌株进行多轮迭代改造 。

（4）多基因编辑：实现多个代谢靶点的连续或同时编辑，构建复杂工程菌 。

6.2 技术优势：

（1）经验丰富：涵盖多形拟杆菌 (Bt)、脆弱拟杆菌 (Bf)、普通拟杆菌 (Bv) 等多个主流种属 。

（2）定制化设计：根据研究目标（如多糖代谢、肠道定植等）设计最优策略 。

（3）全程验证：提供详尽的测序报告与基因型鉴定结果 。

7. 案例介绍

案例：基于CRISPR/Cas的人类肠道共生菌拟杆菌基因组编辑工具开发

项目内容：成功开发了一种高效、多功能的CRISPR/Cas基因组编辑平台，用于人类肠道优势共生菌Bacteroides的基因编辑。

（1）研究背景

Bacteroides是人类肠道微生物组中最丰富的菌属（占肠道菌群的20-30%），在维持肠道健康、代谢调节和免疫平衡中发挥关键作用。其功能异常与肥胖、炎症性肠病、结直肠癌等疾病密切相关。尽管Bacteroides是研究肠道微生物功能的理想模型，但其遗传操作工具仍存在局限：NBU转座子或等位基因交换等方法编辑效率低、依赖选择性标记，且无法实现无标记编辑；CRISPR/Cas技术虽在其他细菌中广泛应用，但针对严格厌氧的Bacteroides物种的优化工具尚不完善；需开发高效编辑工具以解析Bacteroides的基因功能（如多糖利用基因座PULs）、代谢通路及其在肠道生态系统中的作用。本研究旨在填补这一空白，通过构建CRISPR/Cas系统实现Bacteroides的精准、无标记基因组编辑。

（2）方案设计

研究团队设计了全合一质粒系统（all-in-one plasmid），整合了CRISPR/Cas组件、同源修复模板及宿主适应性元件。核心设计包括：

CRISPR系统选择：测试三种Cas蛋白：FnCas12a（识别T-rich PAM）、SpRY（近PAMless）、SpCas9（经典系统），评估其编辑效率。使用诱导型启动子（如aTc诱导的P1TDPGH023）控制Cas表达，以避免组成型表达的毒性。

质粒构建与递送：构建Bacteroides-E. coli穿梭质粒，通过接合转移导入Bacteroides菌株。设计sgRNA靶向特定基因（如Bt1754），并引入同源臂介导修复。

工作流程优化：包括质粒构建、接合转移、Cas诱导表达、突变体筛选和质粒消除五个步骤，确保高效编辑。

关键实验：通过荧光素酶报告系统评估启动子活性（诱导型P1TDPGH023活性优于组成型启动子）。针对不同Bacteroides物种（如B. thetaiotaomicron、B. fragilis）设计物种特异性sgRNA。

（3）实验结论

编辑效率与优化：FnCas12a系统效率最高，在B. thetaiotaomicron中，基因删除效率达60%（SpRY和SpCas9为40%），且诱导型启动子比组成型提高10倍以上。大片段删除能力，成功删除长达50 kb的PUL基因簇（如RGI-PUL），小片段（5-10 kb）删除效率近100%。

多功能性验证：成功将gfp报告基因插入基因组，效率超80%，实现荧光标记。实现跨物种应用，系统在B. fragilis、B. ovatus、B. uniformis和B. vulgatus中均有效，编辑效率达60-100%。删除代谢基因（如Bt1754）后，突变体在果糖培养基中生长受阻，证实基因功能。质粒消除实验显示系统支持多轮编辑，避免抗性基因残留。

（4）应用意义

科研价值：为研究Bacteroides的PUL代谢网络、宿主-微生物互作提供精准工具，例如解析多糖降解通路在肠道生态中的作用。支持多重基因编辑，加速功能基因组学研究。

生物技术应用：可通过编辑基因增强菌株定植能力、递送治疗分子（如抗炎因子），用于代谢疾病治疗。肠道微生物组工程，为设计合成微生物群落、调控肠道环境奠定基础。

技术优势与展望：具有高效性，编辑周期缩短至2-3周，效率远超传统方法。具有普适性，工具适配多种Bacteroides物种，推动肠道菌群研究的标准化。未来结合单碱基编辑、转录调控等技术，可进一步拓展对肠道微生物的精准操控。

8. 参考文献

[1] Wexler, H. M. (2007). Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty. Clinical Microbiology Reviews.

[2] Mimee, M., et al. (2015). Programming a human commensal bacterium, Bacteroides thetaiotaomicron, to sense and respond to stimuli in the murine gut. Cell Systems.

[3] Hecht, A. L., et al. (2016). Composition and function of the human gut microbiome and its impact on health. Nature.

[4] Lim, B., et al. (2017). Engineered Bacteroides for the delivery of therapeutic proteins to the gut. Nature Communications.

[5] Zheng L, et al. (2022). CRISPR/Cas-Based Genome Editing for Human Gut Commensal Bacteroides Species. ACS Synth Biol.

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