乳杆菌基因编辑服务​

乳杆菌 (Lactobacillus) 基因编辑服务

1. 研究背景

乳杆菌是一类极其重要的革兰氏阳性益生菌，广泛应用于食品发酵、医药开发及动物饲料领域。其在维持肠道微生态平衡、调节免疫系统及代谢产物合成中的核心作用使其成为微生物学研究的热点。精准高效的基因编辑技术为深入探究乳杆菌的功能基因组、优化益生特性及构建新型粘膜疫苗递送系统提供了关键工具 。

在此背景下，舒桐生物推出 CRISPR/Cas9 方法进行乳杆菌的基因组改造，可在不同种类的乳杆菌（如植物乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等）中定制化实现目标基因的敲除、大片段缺失、点突变、基因整合（过表达）等服务，交付阳性突变株 。我们致力于为全球科研与工业客户提供专业、可靠的定制化乳杆菌基因编辑解决方案 。

2. 菌种特性与生物学背景

（1）革兰氏染色属性：乳杆菌属于典型的革兰氏阳性菌 (Gram-positive) 。

（2）物理特征：其最显著的物理特征是拥有一层厚实（约 20-80nm）的肽聚糖细胞壁，且缺乏革兰氏阴性菌的外膜结构 。这种厚壁结构常成为遗传转化的物理障碍。

（3）应用价值：作为公认安全 (GRAS) 的微生物，它是研究益生机制、有机酸代谢及抗感染免疫的重要模型 。

（4）代谢与适应：具有极强的耐酸性，能够在极低 pH 环境下存活，是开发功能性食品和生物制剂的理想底盘 。

图1 乳杆菌在培养基平皿中的生长情况

3. 文献报道的编辑策略

针对乳杆菌厚重细胞壁及菌株特异性带来的转化难题，目前主流文献及科研实践中采用的编辑策略包括：

3.1 CRISPR/Cas9 系统（主流方案）：

（1）原理：利用 Cas9 蛋白（含 RuvC 和 HNH 结构域）在 sgRNA 的引导下对目标基因组 DNA 进行位点特异性切割。

（2）优势：通过双链断裂（DSB）诱导修复，可实现高效的基因敲除、大片段缺失或基因整合（过表达）。

3.2 同源重组（Homologous Recombination）：

常配合温度敏感型质粒或自杀质粒使用，通过双交换实现精准的碱基替换或无痕编辑。

3.3 位点特异性重组：

利用重组酶系统（如 Cre/loxP）在特定位点进行基因删除，适用于多基因连续改造。

3.4 转化效率优化：

针对不同菌株（如植物乳杆菌 WCFS1），通过优化电转化参数（如电场强度、缓冲液成分）或使用细胞壁降解酶处理，以克服转化屏障 。

4. 核心应用领域

（1）功能基因组学：精准删除代谢相关基因（敲除），研究其在定植、抗酸或碳源利用过程中的功能 。

（2）益生机制研究：通过点突变模拟关键蛋白变异，解析乳杆菌与宿主肠道细胞相互作用的规律 。

（3）合成生物学改造：在基因组中整合外源抗原基因或报告基因，构建口服疫苗递送系统或环境监控菌株 。

5. 项目流程与验证

我们提供从设计到交付的一站式服务，确保编辑结果的准确性：

（1）方案设计与载体构建：针对目标靶点设计敲除载体。

（2）细菌转化与筛选：通过优化的电转化技术克服乳杆菌转化难点。

（3）多重验证：通过PCR鉴定、Sanger测序确保阳性突变。

图2 项目流程示意图

6. 基因编辑项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）基因敲除/失活：精准删除关键代谢基因，用于构建缺陷株或研究基因功能 。

（2）基因敲入/过表达：在染色体位点插入外源序列（如荧光蛋白、抗原序列），构建稳定遗传的表达菌株 。

（3）点突变/修饰：在基因组中引入特定点突变，研究耐酸、耐胆盐或蛋白功能 。

（4）多基因编辑：实现多个靶点的连续编辑，用于构建复杂代谢通路或高度减毒株 。

6.2 技术优势：

（1）高成功率：优化针对多种乳杆菌（包括工业生产株）的转化和编辑方案 。

（2）定制化设计：根据您的研究目标（如提高产量、增强抗逆性等），设计最优的编辑策略 。

（3）全程验证：提供从方案设计到最终基因型验证的全闭环服务 。

7. 案例介绍

案例：CRISPR/Cas9介导的功能基因在植物乳杆菌WCFS1中的基因组插入

项目内容：成功开发了一种可诱导的双质粒CRISPR/Cas9系统，用于在植物乳杆菌中实现高效、无标记的基因敲入。

（1）研究背景

植物乳杆菌是一种天然存在于人体的乳酸菌，因其安全性、益生特性和蛋白表达能力，被视为有前景的疫苗递送载体。然而，开发细菌递送载体面临两大挑战：传统工程菌株常依赖抗生素抗性基因进行筛选，但临床应用中需避免此类基因；外源质粒表达系统携带大量外源DNA，可能影响菌株稳定性；染色体插入可实现永久性基因表达，但编辑效率低。现有编辑工具（如loxP/Cre系统）存在操作复杂、效率低、遗留疤痕序列等问题。CRISPR/Cas9技术虽在其他微生物中应用成熟，但在植物乳杆菌中仍面临Cas9毒性、同源重组效率低等挑战。本研究旨在开发一种优化的CRISPR/Cas9系统，实现植物乳杆菌的高效基因敲入，为疫苗开发和代谢工程提供工具。

（2）方案设计

双质粒CRISPR/Cas9系统构建：

质粒1（pSIPSh71_LpRec）：携带可诱导表达的重组酶操作子（lp0640-42），受PsppA启动子控制，增强同源定向修复（HDR）效率。

质粒2（pCRISPR系列）：包含Cas9基因、靶向sgRNA和同源修复模板（HDR模板），采用模块化设计便于基因替换。

靶点选择：在基因组非编码区（lp_2071和lp_2074之间）插入基因，避免干扰天然基因功能。

插入基因：mCherry（荧光蛋白），用于评估表达效率。

功能基因：SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD），分为胞质表达和脂蛋白锚定表面展示两种形式。

工作流程优化：先将重组酶质粒导入植物乳杆菌，诱导重组酶表达后，再转化CRISPR质粒。使用PsppA启动子调控Cas9和重组酶表达，减少组成型表达的毒性。采用1 kb同源臂，平衡编辑效率与片段长度兼容性。

（3）实验结论

敲入效率：系统成功插入4种表达盒（长度800–1,300 bp），效率达40%–100%。可诱导表达盒（如PsppA-mCherry）效率较高（42%–50%），而组成型表达盒（PslpA-mCherry）效率仅3%。重组酶关键作用：未诱导重组酶时几乎无敲入事件，诱导后效率显著提升，证实重组酶对HDR的促进作用。

蛋白表达验证：所有敲入菌株均表达目标蛋白，但水平低于质粒表达系统。可诱导敲入菌株信号比组成型高2倍（p < 0.01）。RBD通过脂蛋白锚定在细胞表面，流式细胞术检测到表面抗原，为首次在革兰氏阳性菌中通过CRISPR/Cas9实现表面展示。

系统稳定性：基因稳定性，多次传代后PCR验证插入基因未丢失，表明编辑结果稳定。通过无抗生素培养成功消除辅助质粒，获得无外源DNA工程菌。

（4）应用意义

技术革新价值：提供首个用于植物乳杆菌的高效、模块化CRISPR/Cas9敲入系统，编辑流程缩短至4–5天。模块化设计允许快速更换靶基因和同源臂，促进个性化菌株开发。

疫苗开发前景：成功表达SARS-CoV-2 RBD并实现表面展示，为口服疫苗载体设计铺平道路。无抗性基因工程菌更符合临床安全要求。

工业与科研潜力：可扩展至其他乳酸菌，用于代谢工程（如酶生产）或益生菌功能增强。为研究染色体位置效应对表达的影响提供模型（如插入位点优化）。

局限性与展望：敲入菌株蛋白表达量低于质粒系统，需进一步优化启动子或整合位点。未来可结合单碱基编辑或多重编辑技术，提升应用范围。

8. 参考文献

[1] Kleerebezem, M., et al. (2003). Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. PNAS.

[2] Leenay, R. T., et al. (2015). Establishing CRISPR-Cas9 for genetic engineering in the probiotic Lactobacillus reuteri. Biotechnology and Bioengineering.

[3] Jiang, W., et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology.

[4] van Pijkeren, J. P., & Britton, R. A. (2012). High efficiency CRISPR-Cas9 genome editing in Lactobacillus. Applied and Environmental Microbiology.

[5] Wiull K, et al. (2025). CRISPR/Cas9-mediated genomic insertion of functional genes into Lactiplantibacillus plantarum WCFS1. Microbiol Spectr.

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