乳酸乳球菌菌基因编辑

乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis) 基因编辑服务

1. 研究背景

乳酸乳球菌是一种具有极其重要工业价值且公认安全（GRAS）的革兰氏阳性菌。作为乳制品发酵、风味物质合成及口服疫苗/药物递送系统的核心底盘生物，其遗传改造对于优化工业生产性能和开发新型益生功能至关重要。舒桐生物基于先进的 CRISPR/Cas9 系统与经典的同源重组技术，提供高效、精准的大规模基因组编辑服务，助力全球科研与工业客户。

2. 菌种特性与生物学背景

（1）革兰氏染色属性：乳酸乳球菌属于革兰氏阳性菌 (Gram-positive)。其特征是拥有一层厚实的肽聚糖细胞壁，且不产生芽孢、无动力。

（2）安全性与工业意义：作为首个获得 GRAS 认证的微生物，它在奶酪、酸奶等发酵食品中起关键作用。同时，其简单的代谢途径和分泌机制使其成为异源蛋白表达（如 Nisin、GABA 等）的理想宿主。

（3）代谢特性：典型的同型乳酸发酵细菌，能快速利用糖类产生乳酸，具有优异的酸耐受能力。

图1 乳酸乳球菌NZ9000在培养基平皿中的生长情况

3. 文献报道的编辑策略

针对乳酸乳球菌厚细胞壁带来的转化障碍及工业株存在的限制修饰（RM）系统，主流编辑策略包括：

3.1 CRISPR/Cas9 系统：

（1）原理：利用 Cas9 蛋白在 sgRNA 引导下对目标位点进行特异性切割，作为致死性筛选工具。

（2）优势：配合供体 DNA（Donor DNA）可实现高达 90% 以上的无痕敲除、点突变或基因整合效率。

3.2 同源重组（Homologous Recombination）：

常利用温度敏感型自杀质粒（如 pG+host 系列），通过双交换实现精准编辑。

3.3 Recombineering 重组工程：

利用 Red/ET 样重组系统增强线性片段的整合效率。

3.4 转化效率优化：

针对难转化菌株（如 NZ9000、IL1403），通过优化电转化参数或修饰载体以逃避宿主 RM 系统。

4. 核心应用领域

（1）代谢通路优化：通过基因敲除或过表达，提高乳酸、Nisin（乳酸链球菌肽）或风味物质的产量。

（2）合成生物学应用：构建口服递送底盘，分泌表达治疗性蛋白（如 IL-10）或疫苗抗原。

（3）菌株抗逆性改造：增强菌株在发酵过程中的噬菌体抵抗力、耐酸及耐盐能力。

（4）功能基因组学：精准灭活未知功能基因，解析其在复杂发酵过程中的生理机制。

5. 项目流程与验证

我们提供从设计到交付的一站式服务，确保编辑结果的准确性：

（1）方案设计与载体构建：针对目标靶点设计最优 sgRNA 及同源臂。

（2）细菌转化与筛选：通过优化的电转化技术克服细胞壁屏障。

（3）DNA 靶向切割与修复：Cas9 系统引导双链断裂，利用同源修复模板完成精准编辑。

（4）多重验证：通过PCR鉴定、Sanger测序确保阳性突变。

图2 项目流程示意图

6. 基因编辑项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）基因敲除/失活：精准删除代谢副产物基因（如 nadR），优化工业生产表型。

（2）基因敲入/过表达：在染色体安全位点插入外源基因簇（如 GABA 合成基因），构建稳定表达株。

（3）精准点突变：通过碱基替换改良关键酶的活性或稳定性。

（4）多基因编辑：利用 CRISPR 技术实现多个代谢靶点的连续编辑。

6.2 技术优势：

（1）高成功率：拥有处理多种工业分离株及实验室模型株（MG1363, NZ9000）的丰富经验。

（2）无痕编辑：不引入任何抗性标记，符合食品级应用要求。

（3）周期短：优化的双质粒或单质粒编辑系统显著缩短研发时间。

7. 案例介绍

案例：使用CRISPR-Cas9系统进行乳酸乳球菌NZ9000基因组改造

项目内容：成功针对食品级乳酸菌乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）开发了一种高效CRISPR-Cas9基因编辑平台。

（1）研究背景

乳酸乳球菌是一种重要的食品级乳酸菌，广泛用于乳制品发酵和医疗行业（如益生菌和重组蛋白生产）。传统基因编辑方法（如RecA依赖的同源重组）耗时较长（需20天），且效率低下。CRISPR-Cas9技术虽在其他微生物中应用成熟，但针对乳酸乳球菌的大片段基因编辑工具仍缺乏。本研究旨在开发一种单质粒CRISPR-Cas9系统（pLL系列），实现快速、精准的基因编辑，以加速乳酸乳球菌的功能基因研究和工业应用优化。

（2）方案设计

研究团队构建了基于CRISPR-Cas9的单质粒编辑系统pLL，核心设计包括：

质粒构建：以pHSP02为骨架，整合Cas9表达盒、sgRNA模块、同源臂靶向序列及抗性基因。测试不同启动子（P11、P23、P32、P44）驱动sgRNA表达，以优化编辑效率。

靶点选择：针对乳酸脱氢酶基因（ldh，LLNZ_02045）和尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（upp，LLNZ_11240）进行删除实验。设计sgRNA靶向基因的不同区域（3‘、中间、5’），评估位置对编辑效率的影响。

实验流程：通过电转将pLL质粒导入乳酸乳球菌NZ9000，利用Cas9诱导双链断裂，同源重组修复实现基因删除。通过红霉素抗性筛选转化子，并通过PCR和测序验证编辑结果。研究通过比较不同启动子的活性，发现P23启动子能显著提升sgRNA表达效率，从而优化编辑效果。整体编辑流程可在7天内完成，大幅缩短传统方法所需时间。

（3）实验结论

基因编辑效率：pLL系统对ldh基因的删除效率达8%-50%，其中P23启动子效果最佳（效率50%）。连续删除upp和upp1基因成功，验证系统支持多基因编辑。sgRNA靶向基因不同区域时，编辑效率无显著差异（如upp基因删除效率16%-38%），表明sgRNA结合位置不影响结果。

启动子活性验证：P23和P32启动子的转录活性显著高于P11，能有效减少野生型背景（转化子存活率降低99.9%以上）。

功能验证：删除upp基因的菌株对5-氟尿嘧啶（5-FU）产生抗性，证实upp编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，并验证了基因功能。

sgRNA靶向效率：针对ldh和upp基因不同区域的sgRNA均能高效诱导编辑，致死效率达99.93%-99.98%，表明系统鲁棒性强。

（4）应用意义

技术优势：pLL系统将编辑时间从20天缩短至7天，效率提升至50%，优于传统同源重组方法。单质粒设计简化操作，无需外源重组酶，适用于高通量基因功能筛选。

工业潜力：可用于敲除不良基因（如产酸基因）或引入有益性状，优化乳制品发酵菌株。为开发新型益生菌（如增强肠道定植能力）提供精准编辑工具。

科学价值：为其他乳酸菌的基因编辑提供模板，推动合成生物学在食品微生物中的应用。通过快速基因功能鉴定（如upp基因），加速代谢通路解析。

8. 参考文献

[1] Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes. PNAS.

[2] Guo, T., et al. (2019). Single-plasmid systems based on CRISPR-Cas9 for gene editing in Lactococcus lactis. Microbial Cell Factories.

[3] Jiang, W., et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology.

[4] Van Pijkeren, J. P., & Britton, R. A. (2012). High efficiency CRISPR-Cas9 genome editing in Lactic Acid Bacteria. Applied and Environmental Microbiology.

[5] Song X, et al. (2021). Single-plasmid systems based on CRISPR-Cas9 for gene editing in Lactococcus lactis. J Dairy Sci.

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