沙门氏菌基因编辑

沙门氏菌 (Salmonella) 基因编辑服务

1. 研究背景

沙门氏菌是一种常见且具有重要临床与食品安全意义的肠道致病菌，其多重耐药性（MDR）及复杂的致病机制（如毒力岛 SPIs）研究是微生物学与公共卫生领域的核心挑战 。精准高效的基因编辑技术为深入研究其功能基因组、开发新型减毒疫苗及防控策略提供了关键工具 。

在此背景下，舒桐生物推出 CRISPR/Cas9 方法进行微生物的基因组改造，可在不同血清型的沙门氏菌（如鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等）中定制化实现目标基因的敲除、大片段缺失、点突变、基因整合（过表达）等服务，交付阳性突变株 。我们致力于为全球科研与工业客户提供专业、可靠的定制化沙门氏菌基因编辑解决方案 。

2. 菌种特性与生物学背景

（1）革兰氏染色属性：沙门氏菌属于革兰氏阴性菌 (Gram-negative) 。与革兰氏阳性菌不同，其肽聚糖层较薄，但拥有复杂的外膜结构及脂多糖 (LPS) 层 。

（2）临床意义：它是常见的人类与动物致病菌，可引起食物中毒、肠炎及伤寒等严重疾病 。多重耐药株的出现使其致病机制研究成为核心挑战 。

（3）代谢与应用：具有较强的环境适应能力，是研究细菌毒力岛、生物膜 (Biofilm) 形成及宿主-病原体相互作用（如侵入上皮细胞）的理想模型 。

图1 沙门氏菌在显微镜下的观察图片

3. 文献报道的编辑策略

针对沙门氏菌外膜屏障及内源性重组系统的特性，目前主流文献及科研实践中采用的编辑策略包括 ：

3.1 CRISPR/Cas9 系统（主流方案）：

（1）原理：利用 Cas9 蛋白（含 RuvC 和 HNH 结构域）在 sgRNA 的引导下对目标基因组 DNA 进行位点特异性切割。

（2）优势：通过双链断裂（DSB）诱导修复，可实现高效的基因敲除、大片段缺失或基因整合（过表达）。

3.2 同源重组（Homologous Recombination）：

常配合自杀质粒或穿梭质粒使用，通过上、下游同源臂实现精准的碱基替换或无痕编辑。

3.3 位点特异性重组：

利用重组酶系统（如 Flp/FRT）在特定位点进行基因插入或抗性标记剔除。

3.4 转化效率优化：

通常需要优化电转化条件，以克服外膜导致的转化屏障，尤其针对临床多重耐药分离株。

4. 核心应用领域

（1）功能基因组学：精准删除目标基因（如毒力因子），研究其在感染过程中的功能 。

（2）耐药机制研究：通过点突变模拟自然变异，解析抗生素耐药性的演变规律 。

（3）合成生物学改造：在基因组中插入报告基因（如荧光蛋白），实时监测菌株在宿主体内的动态。

（4）减毒疫苗构建：多基因连续编辑（如敲除 aroA 等关键代谢基因），开发高安全性的疫苗株 。

5. 项目流程与验证

我们提供从设计到交付的一站式服务，确保编辑结果的准确性：

（1）方案设计与载体构建：针对目标靶点设计敲除载体。

（2）细菌转化与筛选：通过优化电转化方案克服转化难点 。

（3）多重验证：通过PCR鉴定、Sanger测序确保阳性突变。

图2 项目流程示意图

6. 基因编辑项目介绍

6.1 核心服务包括：

（1）基因敲除/失活：精准删除或中断目标基因，用于研究毒力岛功能或构建减毒株 。

（2）基因敲入/过表达：在特定位点插入报告基因或外源基因，构建荧光示踪株 。

（3）点突变/修饰：引入特定碱基突变，用于研究关键蛋白位点与耐药表型的关系 。

（4）多基因编辑：实现多个毒力相关基因的连续或同时编辑，构建复杂减毒模型 。

6.2 技术优势：

（1）高成功率：优化针对不同血清型（包括临床耐药株）的转化方案 。

（3）定制化设计：根据您的研究目标（如研究 SPI-1 表达、抗生素耐药性等）设计最优策略 。

（1）全程验证：提供从设计到最终基因型验证的全闭环服务 。

7. 案例介绍

案例：利用CRISPR-Cas9系统靶向改变沙门氏菌sdiA毒力基因

项目内容：研究了通过CRISPR-Cas9技术靶向沙门氏菌sdiA基因（群体感应受体编码基因）对其毒力、宿主互作及抗生素敏感性的影响。

（1）研究背景

肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）是常见的肠道病原体，可引起胃肠炎、伤寒等疾病，其毒力依赖毒力岛（如SPI1和SPI2）编码的III型分泌系统（T3SS）。SPI1-T3SS介导细菌入侵宿主细胞，SPI2-T3SS促进细胞内生存；其中SsaV是SPI2-T3SS的关键组分，其突变可减弱毒力。沙门氏菌通过SdiA受体检测其他细菌产生的AHL信号分子，调控生物膜形成、粘附等毒力行为，但自身不合成AHL。传统基因编辑方法（如λ-Red重组）效率低且耗时，CRISPR-Cas9技术可提供高效、精准的基因组编辑工具，用于研究毒力基因功能及开发减毒疫苗载体。

（2）方案设计

CRISPR-Cas9系统构建：针对sdiA基因设计两个引导序列（Oligo I/II和Oligo III/IV），位于基因的不同区域。使用双质粒系统（pCas9和pCRISPR），分别表达Cas9蛋白和靶向sdiA的crRNA，通过电转导入沙门氏菌野生型（WT）和ΔssaV突变株。通过菌落PCR筛选阳性克隆，测序确认sdiA缺失突变。

实验体系：用HeLa细胞评估细菌粘附能力，在聚苯乙烯板中定量生物膜，通过庆大霉素保护实验分析细菌入侵和胞内复制，构建SseJ-hSurvivin-HA报告系统，评估SPI2-T3SS功能，小鼠感染实验评估突变株毒力。

（3）实验结论

sdiA突变削弱毒力表型：AHL信号显著增强WT和ΔssaV株的粘附和生物膜形成，但sdiA突变株（ΔsdiA和ΔssaVΔsdiA）的粘附能力下降约50-70%（p<0.001）。sdiA突变不影响细菌入侵HeLa细胞，但ΔssaV和双突变株的胞内复制能力降低，表明SPI2功能受损。sdiA和ssaV单突变均降低SPI2效应易位效率，双突变叠加效应更显著。

体内毒力减弱：小鼠模型中，ΔsdiA和双突变株（ΔssaVΔsdiA）的致死率显著低于WT，双突变提供完全保护（p<0.001）。

抗生素敏感性增强：sdiA和ssaV突变株对多种抗生素（如氨苄青霉素、环丙沙星）的MIC和MBIC值降低，表明毒力减弱与耐药性下降相关。

（4）应用意义

疫苗开发前景：ΔssaVΔsdiA双突变株毒力显著减弱，但可能保留免疫原性，有望作为安全疫苗载体，用于递送异源抗原。

抗感染策略：靶向SdiA的群体感应通路可抑制生物膜形成，为抗毒力治疗提供新靶点（如设计AHL类似物抑制剂）。

技术推广价值：本研究验证了CRISPR-Cas9在革兰阴性菌中的高效编辑能力，为其他病原体毒力研究提供模板。

临床意义：突变株抗生素敏感性增强，提示联合基因编辑与抗生素治疗可能改善耐药菌感染预后。

8. 参考文献

[1] Jajere, S. M. (2019). A review of Salmonella enterica with particular focus on the pathogenicity and virulence factors. Veterinary World.

[2] Datsenko, K. A., & Wanner, B. L. (2000). One step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 and Salmonella using PCR products. PNAS.

[3] Jiang, W., et al. (2013). RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology.

[4] Cui, L., & Bikard, D. (2016). Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli and Salmonella. Nucleic Acids Research.

[5] Askoura M, et al. (2021). Alteration of Salmonella enterica Virulence and Host Pathogenesis through Targeting sdiA by Using the CRISPR-Cas9 System. Microorganisms.

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