ASO/siRNA靶点设计

ASO/siRNA靶点设计

1. 背景介绍

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASO）和小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）作为新一代精准核酸药物，通过序列特异性识别靶标RNA，在基因表达层面实现精准调控，已成为罕见病、遗传性疾病、神经退行性疾病及代谢性疾病治疗的重要手段。ASO主要通过RNase H介导的mRNA降解或空间位阻效应发挥作用；siRNA则依赖RNA诱导沉默复合体（RISC）切割靶mRNA，具有更强的靶向特异性。相比传统小分子和抗体药物，核酸药物具有靶点覆盖广、设计周期短、序列可定制等显著优势，能够针对传统药物难以干预的靶点开发治疗方案，已在全球生物医药研发管线中占据重要战略地位。

随着多款ASO及siRNA药物相继在全球获批上市，覆盖脊髓性肌萎缩症、遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、急性肝卟啉症、高胆固醇血症等多个适应症，核酸药物的临床价值与商业可行性已得到充分验证。与此同时，全球核酸药物研发管线持续扩张，大量候选分子进入临床前及临床开发阶段，市场前景广阔，成为当前生物医药领域最具增长潜力的赛道之一。

然而。核酸药物开发的成功率高度依赖于靶点精准筛选与序列的合理设计。一个优质的 ASO 或 siRNA 序列需同时满足：高靶向特异性、强结合亲和力、良好的药代动力学特性、低脱靶风险及可控的免疫原性。序列设计不当可能导致靶向活性不足、非特异性结合，甚至引发安全性问题，成为药物开发失败的关键因素。

近年来，国际ICH、全球主要监管机构（FDA、EMA、PMDA、CDE）及寡核苷酸安全工作组（OSWG）相继出台相关专项技术指导文件，对ASO/siRNA药物的安全性提出了明确且系统的参考要求。舒桐科技深度理解指南要求与行业共识，基于多年安全性评估服务经验，整合前沿生物信息学算法与专业数据库资源，构建了ASO/siRNA 靶点设计平台，为客户提供从靶点筛选到序列优化的一站式解决方案。

图1 全球核酸药物主要监管文件时间线

2. 设计原理

ASO/siRNA 靶点设计基于 Watson-Crick 碱基配对原理，通过多维度序列特征分析在全基因组范围内系统性筛选最优靶向位点。设计流程分为三个核心阶段：

（1）阶段一：候选靶点初筛

基于靶基因转录本信息，在 mRNA 及 pre-mRNA 的功能区域（外显子、内含子、UTR）中生成候选序列。通过设定序列长度、GC 含量、热力学参数等基础筛选条件，快速排除不符合设计要求的序列，构建初步候选库。

（2）阶段二：序列质量优化

对初筛序列进行多维度评估：

①脱靶风险评估：通过序列同源性比对，识别并排除可能与非目标基因结合的高风险序列；

②SNP 兼容性检测：排除覆盖高频变异位点的序列，确保跨人群适用性；

③RNA 二级结构分析：评估靶区域的空间可及性，优先选择单链开放区域；

④RNase H 切割效率预测（ASO）或 RISC 装载效率评估（siRNA）：量化序列的靶标降解潜力。

（3）阶段三：修饰策略推荐

基于序列特征（如 CpG 基序风险）及作用机制（RNase H 依赖型 vs 空间位阻型），为筛选出的优质序列提供针对性化学修饰方案，包括骨架修饰（如硫代磷酸酯）、糖环修饰（如 2'-MOE、LNA）及碱基修饰（如 5-甲基胞嘧啶），以提升序列的核酸酶抗性、结合亲和力并降低免疫原性。

图2 三阶段靶点设计与序列优化流程

3. 技术特色与优势

（1）符合监管要求的设计标准

严格遵循 FDA《寡核苷酸类药物的非临床安全性评估指南》及 ICH 相关技术原则，设计流程涵盖序列保守性分析、脱靶风险评估、SNP 变异筛查等监管机构重点关注的评估维度，确保设计结果满足 IND 申报的数据要求。

（2）多维度序列质量评分体系

构建涵盖热力学稳定性、RNA 二级结构可及性、酶切效率、脱靶风险及 SNP 兼容性的综合评分模型。通过量化评估各候选序列的综合性能，精准识别兼具高活性与低风险的优质靶点。

（3）ASO 与 siRNA 双平台支持

针对 ASO 和 siRNA 的不同作用机制采用差异化设计策略：ASO 设计侧重 RNase H 切割位点偏好性分析及 Gap 区优化，siRNA 设计则聚焦链稳定性差异、RISC 装载倾向性及 seed 区序列优化，确保设计方案精准适配药物类型。

（4）一站式修饰方案定制

基于序列特征智能推荐化学修饰组合，包括：Gapmer 结构优化（ASO）、全链高稳定性修饰（剪接调控型 ASO）、siRNA 双链不对称修饰等，并针对含 CpG 基序的序列提供免疫原性管控方案，助力客户快速推进化学合成与体外验证。

（5）快速交付，降低研发成本

设计周期仅需 10 个工作日，显著缩短早期研发时间。输出结果可无缝对接后续的化学合成、体外活性验证及脱靶效应评估，形成完整的候选序列筛选-验证闭环。

4. 应用场景

早期候选序列筛选：在药物研发初期，针对已明确的靶基因快速生成并筛选多个候选 ASO/siRNA 序列，结合活性预测与风险评估，优先选择高潜力序列进入化学合成与体外验证阶段，降低后期开发风险。

IND 申报数据支持：提供符合监管要求的靶点设计报告，包含序列筛选依据、多维度质量评估数据及修饰方案说明，作为非临床安全性评估的重要组成部分，支撑 IND 申报文件准备。

序列优化与二次开发：对活性不足或存在安全性隐患的候选序列进行重新设计与优化，通过调整靶向区域、优化序列参数或改进修饰策略，提升序列综合性能。

新适应症拓展研究：针对同一靶基因的不同转录本变体或剪接异构体设计特异性序列，支持药物在新适应症方向的探索性研究。

5. 报告示例展示

舒桐科技提供的 ASO/siRNA 靶点设计报告内容全面、逻辑清晰，涵盖从序列筛选到修饰推荐的完整分析链条。以下以 ASO 设计为例展示报告核心内容（siRNA 设计报告结构类似，侧重点针对 siRNA 作用机制进行调整）。

（1）候选靶点综合评分排序：基于多维度质量评估体系，对所有初筛候选序列进行综合评分并排序。报告以表格形式呈现 Top30 候选序列的详细信息，包括染色体定位、序列组成、靶向功能区域、RNA 二级结构评分、RNase H 切割效率评分、SNP 变异频率及综合排名，帮助客户快速锁定最优序列。

图3 候选 ASO 序列综合评分排序

（2）RNA 二级结构与靶点可及性分析：针对 Top 候选序列的靶向区域，通过 RNA 二级结构预测算法评估该区域的空间可及性。报告提供二级结构评分及可视化分析，标注单链开放区域与双链茎区的分布，明确 ASO 结合难度及潜在位阻风险。

（3）SNP 变异位点筛查：基于公共变异数据库，系统筛查候选序列覆盖区域内的已知 SNP 位点，并标注次要等位基因频率。排除覆盖高频变异位点的序列，确保所设计序列在目标人群中的结合稳定性与疗效一致性。

（4）CpG 基序风险评估：对 Top 5 候选序列进行 CpG 基序检测。若序列含有未修饰的 CpG 二核苷酸，报告将明确标注免疫原性风险，并在修饰推荐部分给出针对性的碱基修饰方案（如将 CpG 位点的胞嘧啶替换为 5-甲基胞嘧啶）。

图4 Top5 候选序列 CpG 基序风险评估

（5）化学修饰方案推荐：基于序列特征及作用机制，为 Top 5 候选序列提供分层修饰策略：

1. 针对 RNase H 依赖型 ASO，推荐经典 Gapmer 修饰（翼区 2'-MOE/LNA + 中间 DNA Gap 区 + 全链硫代磷酸酯骨架）；

2. 针对空间位阻型 ASO 或剪接调控需求，推荐全链高稳定性修饰（如全链吗啉代寡核苷酸 PMO 或全链 2'-OMe 修饰）；

3. 针对含 CpG 基序的高风险序列，额外推荐 5-甲基胞嘧啶修饰以消除免疫刺激活性。

报告以表格形式清晰呈现每个候选序列的推荐修饰策略，便于客户直接对接化学合成环节。

图5 Top5 候选序列化学修饰策略推荐

6. 服务内容与交付

6.1 服务流程

6.2 交付内容

（1）完整的靶点设计分析报告（PDF 格式），包含设计依据、评估结果及Top5候选序列修饰推荐；

（2）候选序列详细信息表（Excel 格式），含序列坐标、评分明细及排序结果；

（3）靶基因功能注释及文献参考（如适用）。

7. 送样要求与项目周期

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics Guidance for Industry. Draft Guidance. November (2024).

[2] Integrated DNA Technologies (IDT). Designing RNase H1 'Gapmer' Antisense Oligonucleotides. Coralville: Integrated DNA Technologies, 2024.

[3] Aartsma-Rus A, Garanto A, van Roon-Mom W, et al. Consensus Guidelines for the Design and In Vitro Preclinical Efficacy Testing N-of-1 Exon Skipping Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2023;33(1):17-25.