ABE/CBE转录组脱靶检测

ABE/CBE转录组脱靶检测

1. 背景介绍

单碱基编辑器（Base Editor）通过将脱氨酶与Cas9切口酶或催化失活型Cas蛋白融合，在不引发DNA双链断裂的情况下，实现靶向位点的精准碱基转换。目前应用最广泛的两类碱基编辑器为：腺嘌呤碱基编辑器（ABE，Adenine Base Editor），利用TadA脱氨酶将A转换为I（读取为G），实现A-to-G精准替换；以及胞嘧啶碱基编辑器（CBE，Cytosine Base Editor），利用APOBEC/AID等家族脱氨酶将C转换为U（读取为T），实现C-to-T精准替换。该技术已在基因治疗、疾病模型构建及功能基因组学研究中展现出重要价值。然而，脱氨酶固有的序列宽容性或gRNA非完全特异性可能引发“脱靶编辑”，即在非预期基因组或转录组位点产生非预期碱基修饰，构成潜在的安全性风险与实验干扰。BE转录组脱靶原理具体表现为CBE和ABE所融合的脱氨酶（如APOBEC家族或TadA）在生化本质上均可作用于单链RNA，其在细胞内的自由扩散使其得以脱离gRNA引导、独立接触转录组中的mRNA等单链RNA底物，催化非预期的C→U或A→I碱基修饰，进而引发氨基酸替换、提前终止等翻译层面的功能异常。示意图如下：

图1 CBE碱基编辑器脱氨酶的底物作用机制示意图

近年来，基因治疗相关监管指南（如我国NMPA 2022年《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》及FDA 2024年更新指南）均强调，需采用系统化的脱靶评估策略，涵盖生物信息学预测、DNA层面脱靶检测及RNA层面脱靶验证，以全面评估编辑系统的特异性与风险。

转录组mRNA脱靶编辑检测作为该体系中不可或缺的环节，主要针对ABE和CBE脱氨酶在RNA水平可能产生的非靶向编辑活动（分别为A-to-I/G和C-to-U/T转换）。通过对实验样本进行高深度RNA测序与生物信息学分析，可直接检测预测脱靶位点是否在转录本中发生异常编辑，其技术优势包括：

（1）功能直接性：检测转录活跃区域的脱靶事件，更能反映对基因表达与功能的潜在影响；

（2）高灵敏度：可识别低频脱靶信号（灵敏度通常达0.1%），适用于早期安全筛查；

（3）机制揭示：可区分sgRNA依赖性与sgRNA非依赖性脱靶事件，并区分ABE（A-to-I/G）与CBE（C-to-U/T）各自的RNA脱靶特征，为理解脱氨酶活性提供依据；

（4）指导优化：验证预测脱靶位点，为优化ABE/CBE脱氨酶变体（如高保真版ABEmax、evoAPOBEC等）、gRNA设计及递送系统提供数据支持。

舒桐科技依托自主建立的高深度转录组测序与靶向分析流程，开发了系统化的mRNA单靶点脱靶编辑检测平台，旨在为客户提供符合监管要求、科学严谨的脱靶风险评估解决方案，支持基因编辑工具的研发优化与安全转化。

2. 检测原理

转录组 mRNA 单靶点脱靶编辑检测技术基于高深度 RNA 测序，针对生物信息学预测的高风险脱靶位点，检测其在转录本层面是否发生编辑（如碱基替换，插入缺失），从而验证预测脱靶位点的真实性及其功能性影响。

2.1 检测流程

（1）脱靶位点预测：使用 Cas-OFFinder工具预测与靶位点序列相似的潜在脱靶位点，优先选择错配数 ≤ 6个、位于转录活跃区域的位点。

（2）RNA 提取与文库构建：从编辑后样本提取高质量总 RNA，通过 oligo(dT) 磁珠富集 mRNA 或 rRNA 去除法获得目标转录本，构建高深度测序文库（推荐测序深度 ≥ 50M reads）。

（3）高深度测序：使用DNBSEQ-T7进行 PE150 双端测序，确保预测脱靶位点有足够的测序深度（单位点覆盖深度 ≥ 1000×）。

（4）脱靶编辑检测：比对测序数据到参考基因组，针对预测脱靶位点进行变异检测（SNV/Indel calling），统计脱靶编辑频率，并与对照组比较验证脱靶事件的真实性。

2.2 数据分析策略

（1）靶位点编辑效率验证：首先检测目标靶位点的编辑效率，确认编辑成功。计算靶位点的编辑频率（如 CBE 的 C-to-T 转换率、ABE 的 A-to-G 转换率）。

（2）预测脱靶位点编辑检测：针对生物信息学预测的每个脱靶位点，检测其在 RNA 层面是否发生编辑。统计脱靶编辑频率，筛选编辑频率显著高于背景突变率的真实脱靶位点。根据预测结果，进一步判断脱靶位点是sgRNA依赖性脱靶还是sgRNA非依赖性脱靶。

（3）脱靶编辑功能性影响评估：分析脱靶编辑位点的基因组注释（外显子、内含子、UTR、启动子等），评估脱靶编辑对蛋白编码序列的影响（同义突变、错义突变、无义突变）。

（4）肿瘤相关基因风险评估：基于 COSMIC、ONCOGENE 等数据库，评估脱靶位点所在基因是否为致癌基因或抑癌基因，评估潜在致癌风险。

相比传统的 Sanger 测序或靶向扩增子测序，转录组高深度测序能够同时检测数十至数百个预测脱靶位点，显著提高检测通量；同时高测序深度（单位点 ≥ 1000×）可检测低频脱靶事件（灵敏度可达 0.1%），远超传统方法。

图2 基于mRNA高深度测序的碱基编辑器脱靶检测工作流程

3. 技术优势

3.1高通量覆盖预测脱靶位点

（1）一次实验可同时检测数十至数百个生物信息学预测的脱靶位点；

（2）覆盖转录活跃区域的所有预测脱靶位点，优先识别功能性脱靶事件；

（3）相比单个位点的 Sanger 测序或 qPCR 验证，显著提高检测效率。

3.2 高灵敏度低频脱靶检测

（1）推荐测序深度 ≥ 50M clean reads，确保预测脱靶位点有足够覆盖深度（单位点 ≥ 1000×）；

（2）高深度测序可检测低频脱靶编辑事件，灵敏度可达 0.1%；

（3）采用专业变异检测算法（如 GATK、VarScan2）消除测序错误和背景突变噪音。

3.3 功能性脱靶评估

（1）检测转录活跃区域的脱靶编辑，反映脱靶对细胞功能的实际影响；

（2）评估脱靶编辑对蛋白编码序列的影响（同义/错义/无义突变），预测功能性后果；

（3）整合肿瘤相关基因数据库，评估脱靶位点的致癌风险。

4. 应用场景与服务优势

4.1 应用场景

（1）基因编辑产品 IND 申报支持：提供符合监管要求的转录组脱靶编辑检测报告，验证生物信息学预测脱靶位点的真实性，满足 NMPA/FDA 对单靶点编辑脱靶安全性评价的数据要求。

（2）gRNA 设计优化与筛选：比较不同 gRNA 设计的脱靶编辑情况，筛选脱靶效应最低的 gRNA 序列，优化编辑方案。

（3）编辑工具安全性评估：评估不同编辑工具在 RNA 层面的脱靶编辑特征，验证其安全性优势。

（4）临床前安全性研究：在细胞系、类器官或动物模型中评估单靶点基因编辑的脱靶编辑情况，提供临床试验设计的安全性依据。

（5）细胞治疗产品质控：对 CAR-T、TCR-T 等工程化细胞产品进行转录组脱靶编辑检测，确保编辑特异性和产品安全性。

4.2 服务优势

（1）经验丰富的技术平台：已完成超过上千例基因编辑相关转录组项目，积累丰富的脱靶编辑检测经验，涵盖 CRISPR/Cas9、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、先导编辑器等多种编辑工具，尤其在 ABE/CBE RNA 脱靶检测领域具有深厚技术积累。

（2）双体系质量认证：同时运行 ISO9001 质量管理体系与CNAS实验室认可标准，数据质量可追溯。

（3）专业生物信息学团队：配备经验丰富的生信分析师，提供定制化脱靶位点预测与分析方案，包括针对不同编辑类型的特异性脱靶检测策略。

（4）监管申报支持：提供符合 ICH、NMPA、FDA 要求的标准化报告，可直接支持 IND/BLA 申报。

（5）一站式整合服务：可整合脱靶位点预测、DNA 层面脱靶检测与 RNA 层面脱靶编辑检测，提供多维度脱靶评估。

5. 转录组单靶点脱靶编辑检测报告示例

舒桐科技提供符合监管要求的全面转录组脱靶编辑检测报告。以下以碱基编辑器（CBE）单靶点编辑项目为例，展示报告的核心内容（其他类型的单靶点编辑项目报告结构类似）：

5.1 数据质量评估

提供测序数据量统计、碱基质量分布、GC 含量分析、比对率评估，确保数据质量符合分析要求。包括质控前数据表格和质控后数据表格。验证测序深度是否达到预测脱靶位点检测要求（≥ 50M reads，预测脱靶位点平均覆盖深度 ≥ 1000×）。

原始下机数据示例

质控和比对数据示例

数据测序深度示例

5.2 靶位点编辑效率验证

检测目标靶位点的编辑效率，确认编辑成功。CBE 编辑示例：统计靶位点的 C-to-T 转换频率，提供靶位点编辑效率IGV图。展示靶位点周围序列的编辑情况（如存在多个 C 碱基时的编辑窗口分析）。

目标靶位点检测结果示例

图3 CBE编辑组靶位点测序覆盖及C-to-U编辑事件IGV可视化

5.3 脱靶位点编辑检测结果

针对每个脱靶位点，提供详细的编辑检测结果：测序覆盖深度、编辑频率（编辑型 reads 数 / 总 reads 数）、对照组背景突变率。CBE 编辑示例：检测每个预测脱靶位点的 C-to-U 转换频率，筛选显著高于背景的真实脱靶位点。提供脱靶编辑频率柱状图和脱靶位点分布图。

脱靶位点检测结果示例

图4 12种碱基编辑类型的数量

图5 编辑位点编辑效率分布曼哈顿图

5.4 脱靶位点功能性影响分析

分析检测到的脱靶编辑位点的功能性影响：基因组注释（外显子/内含子/UTR/启动子/基因间区）、蛋白编码影响（同义突变/错义突变/无义突变/移码突变）、氨基酸改变预测、蛋白功能域影响分析。CBE 编辑示例：针对外显子区的 C-to-U编辑，预测其导致的氨基酸改变。

脱靶位点功能性影响结果示例

图6 编辑位点功能注释

5.5 预测脱靶位点列表

提供生物信息学预测的所有脱靶位点列表，包括：脱靶位点基因组坐标、错配数、错配位置、所在基因信息、基因组注释（外显子/内含子/UTR/启动子等）。CBE 编辑示例：优先列出含 C 碱基的预测脱靶位点。

预测脱靶位点结果示例

根据预测脱靶位点和检测脱靶位点联合分析，进一步将脱靶位点分为sgRNA依赖性和非依赖性。

5.6 肿瘤相关基因风险评估

基于 COSMIC、ONCOGENE 等数据库，评估脱靶位点所在基因是否为致癌基因或抑癌基因。提供肿瘤相关基因列表及其脱靶编辑情况，重点标注高风险脱靶事件（如抑癌基因的无义突变、致癌基因的激活突变）。

5.7 脱靶编辑总结与风险评估

提供脱靶编辑检测总结表：检测的预测脱靶位点总数、检测到脱靶编辑的位点数、高频脱靶位点（编辑频率 ≥ 1%）数量、功能性脱靶位点（外显子区错义/无义突变）数量、高风险脱靶位点（肿瘤相关基因）数量。综合评估单靶点编辑的脱靶风险等级（低/中/高），提供优化建议（如更换 gRNA、优化编辑条件等）。

6. 转录组脱靶编辑检测服务内容

7. 样本要求

（1）所有 RNA 样本必须符合上述质量标准，建议使用 RNA 稳定保存液或 -80°C 保存，干冰运输。

（2）客户也可以寄送细胞或组织样本用于 RNA 提取。

（3）必须提供完整的编辑信息（靶序列、gRNA、编辑工具类型等），以便进行准确的脱靶位点预测和编辑检测。

（4）对于特殊编辑类型或特殊分析需求，请提前与舒桐技术团队沟通（联系方式：电话 15336557985 | 技术支持 service@generulor.com.）。

8. 参考文献

[1] 国家药品监督管理局药品审评中心. (2022). 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）。

[2] FDA. (2024). Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing - Guidance for Industry.

[3] Grunewald， J.， et al. (2019). Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature， 569(7756)， 433-437.

[4] Kim， D.， et al. (2019). Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology， 37(4)， 430-435.

[5] Zuo， E.， et al. (2019). Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science， 364(6437)， 289-292.