cfDNA低频突变和DNA甲基化检测
cfDNA低频突变和DNA甲基化检测
1. 背景介绍
液体活检（Liquid Biopsy）作为一项革命性的技术，正深刻改变着基础科研与临床诊断的面貌。通过对血液、尿液等体液中生物标志物的分析，研究人员能够在无需侵入性组织活检的情况下，获取关于机体生理或病理状态的关键分子信息。其中，循环游离DNA（cfDNA）因其承载着来源组织的遗传与表观遗传信息，已成为液体活检领域中最具潜力的生物标志物之一。
然而，cfDNA分析面临两大核心挑战。其一，是信号的“灵敏度”问题。目标cfDNA分子在体液中含量极为稀少，其携带的关键突变频率通常远低于常规二代测序（NGS）的检测极限（错误率~0.1-1%）。其二，是信号的“溯源”问题。体液中的cfDNA是一个包含了来自全身不同组织和器官信号的混合体，仅仅检测到异常信号是不够的，更关键的问题是——这个信号来自哪里？是原发肿瘤、新的转移灶，还是移植的器官?
在新兴的In Vivo基因治疗领域，这两大挑战尤为突出。In Vivo CAR-T等疗法通过直接注射载体实现体内基因修饰，但整合型病毒载体可能在全身多个组织中发生整合，传统的外周血细胞检测存在“监测盲区”，无法全面评估整合风险和脱靶效应。
我们引入了基于双链分子标签的MethylSaferSeqS超高灵敏度检测技术，能够将突变检测灵敏度提升至前所未有的0.001%水平。我们进一步整合了基于差异甲基化区域（DMR）和差异甲基化位点（DMS）的组织溯源分析技术。DNA甲基化模式在不同组织和细胞类型中具有高度的特异性，如同每个组织独有的“表观遗传邮编”。通过分析这些组织特异性的DMR和DMS，我们能够对血浆中复杂的cfDNA混合物进行解卷积，精准识别并定量不同组织来源的cfDNA组分。
图1 液体活检概念、技术挑战与解决方案
2. 技术原理
2.1 MethylSaferSeqS技术
MethylSaferSeqS技术的核心在于其独特的双链分子条形码（Unique Identifier， UID）和冗余测序策略，旨在从根本上消除PCR扩增和测序过程中引入的背景噪音错误，从而实现对极低频突变的超高灵敏度检测。该技术流程首先通过为血液中每个原始cfDNA分子的两条单链分别连接上带有唯一分子条形码的Y型接头。随后，通过单引物扩增，生成带有生物素标记的拷贝链，并利用链霉亲和素磁珠将原始模板链与拷贝链分离开。
分离后的原始链和拷贝链将分别进行独立的文库构建和PCR扩增，形成两个独立的“UID家族”。在测序完成后，通过生物信息学分析，只有在来自同一原始DNA分子的两条链（Watson和Crick链）的UID家族中均被检测到的突变，才被定义为真实的体细胞突变。这种双重验证机制，也被称为“双链测序”，能够将测序错误率降低至千万分之一以下，从而极大地提高了检测的特异性和准确性，使其能够从复杂的背景噪音中精准识别出频率低至0.001%的真实突变事件。
图2 MethylSaferSeqS技术流程
2.2 DMR/DMS的组织溯源
在检测到突变信号之后，我们还需要回答两个关键问题：“有多少肿瘤信号？”和 “信号来自哪里？”，我们整合的甲基化分析模块，通过差异甲基化位点（DMS）和差异甲基化区域（DMR）两种互补策略提供精准答案。
（1） DMS分析：精确定量肿瘤负荷
DMS（差异甲基化位点）是肿瘤与正常组织间单个CpG位点的甲基化差异，如同肿瘤的“甲基化指纹”。通过评估肿瘤特异性DMS的甲基化状态，计算肿瘤样位点比例（pTS），从而精确定量肿瘤负荷（TC），即使在0.5-1%的极低含量下仍准确可靠。
（2） DMR分析：高精度组织来源溯源
DMR（差异甲基化区域）是包含多个CpG位点的连续区域，在不同组织间呈现稳定的甲基化模式差异。我们利用公共数据库构建了涵盖多种组织、肿瘤类型及亚型的DMR参考图谱。通过信号解卷积算法，可实现：区分肿瘤与正常组织（ctDNA+/-分类）、推断肿瘤分子亚型（如ER状态）、追溯组织来源（定量不同组织cfDNA贡献比例）。
3. 技术创新与优势
MethylSaferSeqS + DMR/DMS技术为液体活检研究提供了前所未有的深度和广度，其核心优势在于突破了传统方法的局限，适用于多种需要超高灵敏度检测和精准溯源的科研场景：
优势 | 详细说明 |
|---|---|
超高灵敏度 | 能够精准检测频率低至 0.001% 的分子事件，使研究者能够捕捉到极其微弱的生物学信号，例如肿瘤早期释放的ctDNA或极少数存在的耐药克隆 |
极高特异性 | 通过创新的双链分子标签和双重验证测序策略，可将背景噪音错误率控制在 <5 x 10⁻⁷以下，确保检测结果的高度可靠性，避免假阳性结果的干扰 |
多维信息获取 | 平台可在单次检测中同时分析基因突变（SNV/Indel）和DNA甲基化 两种信息，为疾病的发生发展、治疗反应等复杂生物学过程提供更全面的分子视图，助力多组学研究 |
广泛样本兼容 | 适用于血浆、尿液、脑脊液等多种体液样本中的低起始量cfDNA（≥10 ng），为各种科研设计提供了极大的灵活性，便于开展微创、无创的动态监测研究 |
精准组织溯源 | 通过DMR/DMS分析，能够精确识别并定量不同组织来源的cfDNA，解决“信号来自哪里”的关键问题，为复杂疾病的诊断和监测提供重要依据 |
4. 应用场景
4.1 基因与细胞治疗
（1） In Vivo基因治疗安全性监测:
体内（In Vivo）基因治疗（如In Vivo CAR-T）通过直接注射载体实现体内T细胞修饰，但整合型病毒载体的随机整合可能激活原癌基因或抑制抑癌基因，带来插入突变风险。通过cfDNA超高灵敏度检测，可无创监测载体在全身组织（淋巴结、脾脏、肝脏等）的整合事件，鉴定高风险整合位点(如邻近MYC、TP53等关键基因)，动态追踪克隆丰度变化，及时发现异常扩增信号。结合DMR组织溯源分析，可精准识别脱靶发生的组织位置，满足FDA/NMPA对基因治疗产品15年长期随访（LTFU）的监管要求，为疗法的长期安全性提供关键数据支持。
（2） Ex Vivo CAR-T等细胞疗法持久性追踪
定量监测体内治疗性细胞的动态变化和长期存续状态。
4.2 肿瘤学研究
（1） 微小残留病（MRD）监测：在抗肿瘤治疗后，超高灵敏度地检测血液中残留的肿瘤DNA，为评估治疗深度、预测复发风险提供精准依据。
（2） 耐药机制探索：动态追踪治疗过程中新出现的低频耐药突变，揭示肿瘤演进和耐药的新机制。
（3） 肿瘤异质性研究：深入分析原发灶与转移灶的基因组差异，以及肿瘤内部不同亚克隆的构成。通过DMR分析，可区分不同转移灶来源的cfDNA。
4.3 移植医学研究
移植物来源cfDNA监测：通过供受体特异性DMR，超高灵敏度检测器官移植或骨髓移植后供体来源的DNA片段，为早期发现排斥反应、感染或疾病复发提供新的研究工具。
4.4 复杂疾病研究
（1） 多器官损伤评估：通过器官特异性DMR同时监测肝、肾、心脏等多器官损伤情况，为重症疾病、药物毒性等研究提供全面的分子标志物。
（2） 体细胞嵌合现象研究：检测和定量分析组织或血液中随年龄增长而累积的低频体细胞突变，探索其与衰老及相关疾病的关系。
5. 示例结果
（1） 低频突变检测
基于MethylSaferSeqS双链分子标签技术，对血浆cfDNA检测频率低至0.001%的体细胞突变。重点关注肿瘤相关基因（TP53、PIK3CA、ESR1、BRCA2、EGFR等）的单核苷酸变异（SNV）和小片段插入缺失（Indel），提供突变频率（VAF）、覆盖深度及临床意义注释。
图3 低频突变检测结果
（2） 肿瘤负荷定量（DMS分析）
采用差异甲基化位点（DMS）分析方法，评估血浆cfDNA中肿瘤特异性甲基化模式的CpG位点比例（pTS），精确定量肿瘤含量（Tumor Content， TC）。分析1，245个肿瘤类型特异性DMS位点，计算肿瘤样位点比例及95%置信区间，实现对0.5-1%低肿瘤负荷的准确评估。
（3） 组织来源分析（DMR分析）
利用差异甲基化区域（DMR）对血浆cfDNA进行组织来源解卷积分析。基于TCGA、ENCODE等公共数据库构建的组织特异性DMR参考图谱（856个区域），评估映射到不同组织DMR的reads甲基化状态，计算肿瘤样reads比例（pTR），判断ctDNA状态（ctDNA+/-），并定量各组织来源cfDNA的贡献比例（肝脏、造血系统、肺、肿瘤等）。
（4） 肿瘤分子亚型推断
基于亚型特异性DMR，对血浆cfDNA进行肿瘤分子亚型无创推断。针对乳腺癌样本，评估ER（雌激素受体）、HER2（人表皮生长因子受体2）及Ki67（增殖指数）相关DMR的甲基化模式，通过信号解卷积算法计算各亚型预测分数，判定分子分型（如Luminal A/B、HER2阳性、三阴性等），为精准治疗提供分子依据。
图4 肿瘤分子亚型预测（亚型特异性DMR）
（5） 关键DMR甲基化模式验证
选取5-6个关键的肿瘤相关基因DMR区域（ESR1、BRCA1、TP53、RASSF1、CDH1等），展示其在正常组织参考、肿瘤组织参考及患者cfDNA样本中的甲基化水平。通过热图可视化对比分析，验证患者样本甲基化模式与肿瘤参考的一致性，评估组织来源分析和亚型推断结果的可靠性。
图5 关键DMR甲基化模式验证
6. 服务内容与样本要求
6.1 服务内容
服务环节 | 服务内容 |
|---|---|
| 项目咨询 | 专业的售前技术支持，协助您设计最符合您科研需求的检测方案。 |
样本检测 | 接收血液、组织或DNA样本，进行严格的质检后，执行标准化的超高深度测序流程。 |
数据分析 | 采用先进的生物信息学分析管线，精准鉴定低频突变与甲基化变异，并提供全面的数据分析。 |
报告交付 | 在承诺的周期内交付详尽的检测报告，包含突变检测、肿瘤负荷定量和组织来源分析结果。 |
售后支持 | 提供持续的技术支持和专业的报告解读服务。 |
6.2 样本要求
样本类型 | 送样要求 | 备注 |
|---|---|---|
| 液体cfDNA | ·建议使用专用采血管采集10 mL外周血或50mL以上的尿液，如果其他液体类型请确认最终方案 ·血浆量: ≥ 6 mL；尿清量≥ 40mL ·cfDNA量: ≥ 10 ng | 按照血浆/尿液标准两步离心法收集后，建议增加适量EDTA，立即保存于-20度低温环境，并全程低温运输 |
6.3 样本信息与运输
（1） 信息要求: 每份样本均需清晰标记样本编号，并附上完整的送样单，注明样本类型、来源、处理方式及研究目的。
（2） 运输指南: 请使用足量干冰（针对冻存样本）或蓝冰（针对冷藏样本）进行运输，并选择可靠的快递服务，以确保样本在运输过程中的稳定与安全。
注: 若样本不符合上述要求，可能会影响数据质量、延长检测周期或导致实验失败。如有特殊样本类型，请务必提前与我们的技术支持团队联系沟通。
7. 参考文献
[1] Crowley， E.， et al. （2013）. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology， 10（8）， pp.472-484.
[2] Kaiser， J. （2019）. CRISPR's unwanted anniversary. Science， 365（6459）， pp.1224-1228.
[3] Newman， A. M.， et al. （2016）. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nature Biotechnology， 34（5）， pp.547-555.