ASO/siRNA筛选与验证

ASO/siRNA筛选与验证

1. 背景介绍

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASO）和小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）作为新一代精准核酸药物，通过序列特异性识别靶标RNA，在基因表达层面实现精准调控，已成为罕见病、遗传性疾病、神经退行性疾病及代谢性疾病治疗的重要手段。ASO主要通过RNase H介导的mRNA降解或空间位阻效应发挥作用；siRNA则依赖RNA诱导沉默复合体（RISC）切割靶mRNA，具有更强的靶向特异性。相比传统小分子和抗体药物，核酸药物具有靶点覆盖广、设计周期短、序列可定制等显著优势，能够针对传统药物难以干预的靶点开发治疗方案，已在全球生物医药研发管线中占据重要战略地位。

随着多款ASO及siRNA药物相继在全球获批上市，覆盖脊髓性肌萎缩症、遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、急性肝卟啉症、高胆固醇血症等多个适应症，核酸药物的临床价值与商业可行性已得到充分验证。与此同时，全球核酸药物研发管线持续扩张，大量候选分子进入临床前及临床开发阶段，市场前景广阔，成为当前生物医药领域最具增长潜力的赛道之一。

然而，核酸药物开发的成功率高度依赖于序列的精准设计以及全面的安全性评估，从候选序列设计到Lead ASO/siRNA确认，涉及复杂的序列优化、脱靶风险评估、递送策略选择、体外验证等多个环节。ASO/siRNA的安全性风险主要来源于两个维度：其一为序列依赖性（杂交依赖性）脱靶效应——由于核酸序列的高度相似性，药物可能与非目标基因发生非预期杂交结合，引发杂交依赖性脱靶效应（Hybridization-Dependent Off-Target Effects），导致非靶标基因表达异常，是核酸药物临床前毒性信号的重要来源之一；其二为序列非依赖性效应——例如ASO可能引发的补体激活、凝血功能干扰等类效应（class effects），以及siRNA通过TLR7/TLR8等固有免疫受体激活所引发的免疫刺激反应等。近年来，国际ICH、全球主要监管机构（FDA、EMA、PMDA、CDE）及寡核苷酸安全工作组（OSWG）相继出台相关专项技术指导文件，对ASO/siRNA药物的安全性评估提出了明确且系统的参考要求。

图1 全球核酸药物主要监管文件时间线

舒桐科技深度理解指南要求与行业共识，基于多年安全性评估服务经验，整合前沿生物信息学算法与专业实验验证平台，建立了从靶点设计到Lead ASO/siRNA确认的一站式筛选与验证体系，帮助客户快速、经济、高效地筛选出具有临床转化潜力的ASO候选药物。

2. 服务定位与技术路线

我们采用“设计→合成→筛选→优化→确认”的分阶段漏斗策略，系统化地从大量候选序列中筛选出最优分子。针对ASO和siRNA的不同作用机制和技术特点，提供差异化的筛选验证策略。

ASO筛选路线：采用2'-MOE Gapmer等化学修饰策略，重点评估RNase H活性、靶点可及性、RNA二级结构影响，以及Gymnotic摄取能力（无转染试剂条件下的细胞内递送效率），为体内应用提供关键数据支持。

siRNA筛选路线：综合评估guide strand（引导链）和passenger strand（乘客链）的脱靶风险，优化2'-OMe、2'-F等化学修饰位点，验证RISC复合物装载效率，评估种子区（seed region）的脱靶潜力，并根据递送策略（脂质纳米颗粒LNP、GalNAc偶联等）进行针对性的效力验证。

分阶段漏斗式筛选流程：如下所示，通过四个递进阶段实现从海量候选到Lead分子的高效筛选：

（1）智能化设计阶段 - 基于多算法整合与全转录组脱靶筛查，从靶基因快速生成高质量候选池（ASO 50+条，siRNA 30-50条），计算机预筛选出Top候选进入实验验证；

（2）高通量初筛阶段 - 采用三浓度梯度快速评估药效，结合脱靶风险初评，筛选出综合表现优异的Top 5候选；

（3）Lead优化阶段 - 完整剂量-效应关系验证，mRNA与蛋白双重确认，精准计算治疗窗口，针对siRNA额外评估免疫原性与长效性，筛选出Top 2-3 Lead候选；

（4）Lead确认阶段 - 模拟体内递送环境（ASO的Gymnotic摄取，siRNA的LNP/GalNAc递送），预测体内药效，最终确认1-2条进入临床前研究的Lead分子。

我们的服务定位于为生物制药企业、科研院所和临床研究者提供从计算机辅助设计到Lead ASO确认的系统化筛选与验证服务，显著缩短研发周期，降低早期开发风险。

图2 分阶段筛选策略流程图

3. 技术优势

（1）符合国际标准，数据可直接用于IND申报

严格遵循FDA 2024年《寡核苷酸类药物非临床安全性评估指南》、OSWG 2024脱靶评估指南、N-of-1 Collaborative 2023共识等国际标准。所有实验参数、对照组设置、数据分析方法均有明确的FDA/文献依据，可追溯性强，符合监管预期，避免因数据质量问题导致IND申报延迟。

（2）成本效益优化，相比传统方法节省30-50%

通过分阶段筛选，在每个节点设置明确的淘汰标准，避免对低质量候选进行昂贵的全面验证。例如，初筛阶段仅需3个浓度点即可淘汰50%的候选，显著降低后续验证成本。整体成本比一次性全面验证所有候选降低30-50%，周期缩短25%以上。

（3）多维度验证体系，确保Lead质量

不仅验证mRNA水平，还包括蛋白验证（Western Blot）、Gymnotic摄取、细胞毒性评估、治疗窗口分析等多个维度。采用4PL模型精确计算IC50/EC50，确保数据准确可靠。全方位评估保证筛选出的Lead具有高成功率，避免因单一指标优秀但综合表现不佳导致后续开发失败。

（4）专业经验积累，参考FDA批准案例

基于已成功获批上市的ASO/siRNA药物开发路径以及全球重要监管机构发布的相关指南文件，建立了成熟的筛选验证体系。我们的筛选策略、质控标准、数据分析方法均经过大量项目验证，成功率达85%以上。

4. 应用场景

（1）药物发现早期筛选：快速评估多个ASO/siRNA候选序列的药效和安全性，为靶点验证和先导化合物筛选提供数据支持；

（2）IND申报准备：提供符合FDA/EMA监管要求的系统性筛选验证数据，支持CMC（化学、制造和控制）开发和非临床安全性评估；

（3）Lead优化决策：深入验证候选分子，为进入体内研究提供充分依据。针对ASO评估Gymnotic摄取潜力，针对siRNA评估不同递送策略的适配性；

（4）递送策略选择：对于siRNA项目，通过LNP制剂评估、GalNAc偶联效力验证、体外靶向性测试等，帮助客户选择最优递送平台；

（5）体内实验设计：通过体外长时效验证、重复给药模拟等预测体内效果，优化剂量和给药方案，降低动物实验成本；

（6）开发风险控制：多维度评估降低后续开发失败风险，特别是脱靶毒性、免疫原性（siRNA）、肝毒性等关键安全性问题的早期识别。

5. 交付成果展示

舒桐科技提供的不仅是实验数据，更是完整的决策支持体系。每个阶段的交付报告都经过专业分析和可视化处理，帮助客户快速理解结果、做出明智决策。

5.1 初筛阶段（快速定位高潜力候选）

通过浓度梯度筛选与综合评分体系，直观展示各候选分子的药效表现与浓度依赖性。报告包含候选分子综合排序、脱靶风险初评（siRNA专项）、以及Top 5推荐清单与优化建议，帮助客户快速锁定进入下一阶段的候选。

交付亮点： 热图可视化 + 综合评分排序 + 质控数据完整性验证。

5.2   Lead优化阶段（精准评估成药潜力）

完整的剂量-反应曲线与治疗窗口分析，结合mRNA与蛋白水平双重验证，精确计算IC50/CC50等关键参数。针对siRNA，额外提供passenger链脱靶评估、免疫原性检测、长效性验证等专项数据。通过多维度雷达图直观对比Top候选的综合表现。

交付亮点： 多维度综合评分 + 体内转化潜力预测

5.3 Lead确认阶段（递送策略匹配与体内预测）

根据分子类型提供针对性验证：ASO的Gymnotic摄取评估预测体内直接递送潜力；siRNA的LNP/GalNAc递送效率验证，评估不同递送平台的适配性。长时效验证（96-120h）为体内给药方案设计提供关键参考依据。最终交付Lead分子完整评估报告。

交付亮点：递送策略适配性评估 + 体内效果预测 + IND申报级数据包

6. 服务项目与周期

7. 送样要求

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics Guidance for Industry. Draft Guidance. November (2024).

[2] Andersson, P. et al. Assessing Hybridization-Dependent Off-Target Risk for Therapeutic Oligonucleotides: Updated Industry Recommendations. Nucleic Acid Ther. (2024).

[3] Stein CA, Hansen JB, Lai J, et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 2010 Jan;38(1):e3.

[4] Finkel RS, Mercuri E, Darras BT, et al. Nusinersen versus Sham Control in Infantile-Onset Spinal Muscular Atrophy. N Engl J Med. 2017 Nov;377(18):1723-1732.

[5] Adams D, Gonzalez-Duarte A, O'Riordan WD, et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2018 Jul;379(1):11-21.

[6] Balwani M, Sardh E, Ventura P, et al. Phase 3 Trial of RNAi Therapeutic Givosiran for Acute Intermittent Porphyria. N Engl J Med. 2020 Jun;382(24):2289-2301.

[7] Garrelfs SF, Frishberg Y, Hulton SA, et al. Lumasiran, an RNAi Therapeutic for Primary Hyperoxaluria Type 1. N Engl J Med. 2021 Apr;384(13):1216-1226.

[8] Ray KK, Wright RS, Kallend D, et al. Two Phase 3 Trials of Inclisiran in Patients with Elevated LDL Cholesterol. N Engl J Med. 2020 Apr;382(16):1507-1519.