体内基因治疗（in vivo）解决方案
体内基因治疗（in vivo）解决方案
1、行业背景
体内基因治疗（in vivo gene therapy）通过将基因编辑工具或治疗性基因直接递送至患者体内靶组织，在原位实现基因敲除、修复或表达调控，避免体外细胞操作流程，具备“即用型”优势和更广泛的临床适应症潜力。
然而，体内递送始终面临三大核心挑战：
递送效率不足（尤其在难转染细胞与复杂组织中）
长期安全性风险（病毒整合、持续表达）
临床转化与监管压力
舒桐医疗围绕上述痛点，构建了以Mini Circle DNA载体与LvNP（Lentivirus Nanoparticle）递送系统为核心的体内基因治疗整体解决方案，兼顾效率、安全性与临床可行性。
2、解决方案概述——Mini Circle DNA × LvNP 递送 × 全维度安全性评估
舒桐医疗提供从递送载体制备、体内高效递送，到编辑效率验证与安全性评估的一站式体内基因治疗技术服务，助力客户高效推进临床前研究与 IND 申报。
核心优势：
病毒级递送效率
非整合型安全设计
体内表达高度可控
数据完整、符合监管预期
3、技术路线
阶段一：基因载体制备
传统质粒 → Mini Circle 转化 → 去除细菌骨架 → 高纯度 Mini Circle DNA
阶段二：LvNP（Lentivirus Nanoparticle）递送系统
Mini Circle DNA / mRNA / 编辑蛋白→ LvNP 工程化装配→ 病毒样纳米颗粒形成→ 体内高效递送
LvNP 通过工程化 Gag / Gag-Pol 结构蛋白的自组装形成类病毒颗粒，在颗粒成熟过程中高效封装功能性分子，并依托慢病毒天然的膜融合与入胞机制，实现对体内靶细胞的高效递送。
阶段三：体内编辑效率验证
动物给药 → 多组织取样 → NGS 扩增子测序 → 编辑效率定量分析
阶段四：全维度安全性评估
脱靶分析 / 整合位点分析 / 染色体结构变异 / 生物分布检测
4、模块详解
模块一：Minicircle DNA
微环质粒（Minicircle DNA, mcDNA）是一种非病毒、染色体外、共价闭合的超螺旋环状基因表达载体，通过位点特异性重组技术从传统质粒（plasmid）中删除细菌骨架序列（如复制起点、抗生素抗性基因、未甲基化CpG基序等）衍生而来。其核心特征是仅保留真核表达盒（包括启动子、目的基因（GOI）、polyA信号等），去除了传统质粒中可能导致免疫原性、基因沉默或整合风险的原核序列。这种“极简主义”设计使微环质粒成为一种更安全、高效的基因递送工具。
模块二：LvNP（Lentivirus Nanoparticle）递送系统
（1） 什么是 LvNP？
与传统慢病毒载体不同，LvNP不携带完整病毒RNA基因组，不发生反转录，不整合至宿主基因组，不具备复制能力。其设计理念是在最大程度保留慢病毒天然高效入胞和膜融合能力的同时，彻底规避插入突变和长期表达带来的安全性风险，从而为体内基因编辑和短期表达应用提供更优递送方案。
（2） LvNP与其他主流递送体系的本质区别
| 维度 | LvNP（Lentivirus NP） | LNP（Lipid NP） | 传统慢病毒载体 |
| 递送机制 | 病毒样膜融合 | 内吞为主 | 病毒感染 |
| 递送效率 | 病毒级，高 | 中等 | 高 |
| 递送内容 | 蛋白/RNP/核酸 | mRNA/DNA | DNA |
| 基因组整合 | 不整合 | 不整合 | 可能整合 |
| 表达持续性 | 瞬时/短期 | 短期 | 长期 |
| 体内基因编辑适配性 | 极高 | 中等 | 安全性受限 |
（3） LvNP 的工程化特征
仅保留慢病毒结构与装配相关功能模块
不包含任何病毒复制或整合相关遗传元件
可高效递送 Cas9 RNP、Base Editor 蛋白、Prime Editor 复合物等
递送后不形成持续表达载体，显著降低长期安全性风险
适用于一次性或有限次数体内给药的基因编辑策略
（4） LvNP 递送服务内容
| 服务项目 | 说明 |
| LvNP 工程化设计 | 根据递送内容（DNA / mRNA / 蛋白）定制装配策略 |
| 颗粒制备与纯化 | 病毒样纳米颗粒制备与梯度纯化 |
| 理化性质表征 | 粒径、PDI、包封效率、稳定性 |
| 体外功能验证 | 难转染细胞编辑表达效率验证 |
| 体内递送支持 | 小鼠/大鼠体内递送实验（可选） |
（5） LvNP 的技术优势总结
高递送效率：继承慢病毒天然入胞与膜融合优势
非整合型安全性：不发生宿主基因组整合
高度适配基因编辑：尤其适合 Cas9 RNP 等蛋白级递送
表达可控：避免长期表达带来的潜在毒性风险
体内友好性强：适用于多组织、复杂体内环境
模块三：体内递送与效率验证
场景一：治疗基因表达递送（以 Mini Circle DNA 为代表）
核心目标：验证治疗性基因在靶组织的成功递送、转录与蛋白表达。
检测内容：
（1）转基因 mRNA 转录水平：通过 RT-qPCR 或 RT-ddPCR 定量检测靶组织中外源基因的 mRNA 表达丰度，评估转录效率与持续时间。
（2）蛋白表达水平：采用Western Blot、ELISA或免疫组化（IHC）等方法，验证目标蛋白在靶器官的表达强度与分布模式。
（3）组织分布差异分析：对比不同剂量、不同时间点下的表达水平波动，为药效窗口期确定提供数据支持。
场景二：基因编辑递送（以 Cas9 mRNA/碱基编辑器/RNP 为代表）
核心目标：量化评估基因编辑工具在活体组织中的精准编辑能力。
检测内容：
（1）Indel 频率：针对 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除，通过高深度 NGS 扩增子测序（>10,000x）分析非同源末端连接（NHEJ）产生的插入/缺失比例。
（2）碱基转换率：针对碱基编辑器（Base Editor），计算目标碱基（如 C→T 或 A→G）的精准转换频率。
（3）先导编辑效率：针对先导编辑（Prime Editing），评估目标序列的精确插入、删除或替换效率。
（4）组织分布差异分析：对比不同剂量、不同时间点下的编辑效率波动，为临床剂量选择提供依据。
模块四：脱靶安全性评估 (Off-Target Analysis)
本模块适用于场景二（基因编辑递送），针对含核酸酶的基因编辑工具在非预期位点的剪切风险，提供“预测+实验+验证”的双重保障。检测策略（依据 NMPA《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》§8.1.6）：
阶段一：生信预测
通过计算生物学方法，在全基因组范围内广泛筛选和预测潜在的脱靶位点。此阶段是脱靶位点寻找过程的第一步，旨在构建一个理论上的潜在脱靶位点候选列表。该阶段的核心是利用算法模型模拟基因编辑工具（如sgRNA）与基因组DNA的结合特异性。
| 评估项目 | 具体方法 |
| 序列同源性比对 | 综合使用Cas-OFFinder、CRISPOR等多种序列设计和脱靶预测软件识别允许一定数量碱基错配的潜在结合位点。 |
| 脱靶评分系统 | 采用CFD Score、MIT Score等评分工具，对每个潜在脱靶位点进行打分，评估其脱靶可能性，并进行排序。 |
阶段二：细胞模拟实验
此阶段是脱靶位点寻找过程的第二步，也是一个关键的实验发现过程。它采用高灵敏度的无偏检测方法，在模拟体内的体外细胞系中，全面评估基因编辑工具的安全性风险。评估内容包括三个维度：全基因组无偏脱靶寻找通过GUIDE-seq和AID-seq技术直接捕获所有切割位点；染色体重排检测通过PEM-seq精确鉴定易位、倒位、大片段缺失等结构变异；核型分析通过G显带染色体核型分析检测染色体数目异常和大片段结构变异，从分子水平到染色体水平系统性评估基因组稳定性风险。
| 评估项目 | 具体方法 |
| 全基因组无偏脱靶寻找 | GUIDE-seq（细胞水平）或AID-seq（生化水平）分别在细胞水平和生化水平全面检测脱靶位点 |
| 染色体重排检测 | PEM-seq针对在靶区域设计生物素标记引物，通过引物延伸捕获跨越重排连接点的DNA片段，精确鉴定易位、倒位、大片段缺失等结构变异的类型、断点位置和频率。 |
| 核型分析 | 通过G显带染色体核型分析，检测基因编辑后细胞的染色体数目异常、大片段易位、倒位等结构变异，评估基因组稳定性 |
阶段三：体内靶向确认
NMPA《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》§8.1.6“在对检测到的脱靶位点，可根据位点位置、基因功能等进行风险分析，必要时可结合动物或人体试验数据综合判断”。最接近临床应用的动物模型体内，对前两个阶段找到的所有潜在脱靶位点进行最终的靶向验证和定量分析。
| 评估项目 | 具体方法 |
| 动物模型给药 | 将基因编辑产品通过临床拟用途径给药至相关动物模型（如小鼠）。 |
| 主要细胞类型分析 | 从靶器官（如肝脏、肿瘤）中分离出发挥疗效的主要细胞类型（如肝细胞、T细胞） |
| 靶向深度测序 | 针对第一阶段和第二阶段发现的所有脱靶位点，设计特异性探针，进行高深度（>5,000x）的液相杂交捕获测序 |
| 风险分析与评估 | 精确定量每个脱靶位点在主要细胞类型中的编辑频率，结合位点所在的基因功能（如是否为癌基因或抑癌基因），综合评估其生物学风险。 |
模块五：整合位点分析 (Integration Site Analysis, ISA)
本模块适用于所有体内基因治疗方案（场景一和场景二），旨在验证 LvNP 递送载体是否发生非预期的宿主基因组整合。
验证 LvNP 的非整合型安全设计：LvNP 设计为不携带反转录酶、不含整合酶相关遗传元件的非整合型递送系统。本检测从实验层面证实其不整合特性，排除插入突变风险。
检测方法：
cfDNA是全身各组织细胞（包括被载体修饰的细胞）释放到血液中的DNA片段，是反映全身基因组事件的“分子快照”。通过对cfDNA中的载体-基因组连接片段进行超高灵敏度检测，能够无创、全面、动态地监控In Vivo CAR-T在全身的整合图谱和克隆演变，实现对潜在插入突变风险的早期预警，能够比临床症状或传统血液学指标更早地发现潜在的优势性克隆扩增，为临床干预和风险管理争取宝贵的时间窗口。
核心技术是基于连接介导PCR（Linker-Mediated PCR， LM-PCR）的靶向扩增技术，结合独特的分子标签（UMI）技术，实现对cfDNA中慢病毒整合位点的高灵敏度、高特异性检测。该技术被称为LiBIS-seq （Liquid Biopsy Integration Site Sequencing）。
个体化风险基线建立：在首次给药后，为每位受试者建立全面的个体化整合位点风险图谱，识别高风险整合事件。
克隆动态长期监测： 在15年长期随访（LTFU）期间，定期进行cfDNA检测，动态追踪克隆丰度变化，及时发现异常扩增信号。
安全性事件归因： 若出现继发性肿瘤等严重不良事件，可通过本技术快速鉴定致病克隆的整合位点，为事件归因提供决定性证据。
监管申报支持： 为IND/BLA申报提供符合FDA/NMPA要求的整合位点安全性数据。
模块六：生物分布检测 (Biodistribution Detection)
描述药物进入体内后的药代动力学（PK）特征及组织亲和性。
（1）定量 PCR (qPCR/ddPCR) 监测：高灵敏度检测不同组织器官中载体拷贝数（Vector Copy Number）的变化曲线。
（2）治疗分子追踪：同步监测 Mini Circle DNA 的转录水平或 mRNA/蛋白的表达动力学，确认药物在靶器官的停留时间。
（3）清除周期研究：评估递送系统及遗传载体在体内的排泄与代谢动力学，确证药物不会在非靶器官产生非预期的长期蓄积。
5、服务模式
模式⼀：Mini Circle + LvNP递送套餐
针对需要完整递送⽅案的客户：
1）亲本质粒构建
2）Mini Circle⽣产（mg级）
3）LvNP包封与表征
4）体外转染效率验证
5）技术咨询⽀持
适合：体内基因治疗早期研发客户
模式二：体内安全性评估包（IND申报）
| 套餐包 | 包含项目 | 适用场景 |
| 标准包 | 整合位点分析 + 生物分布 | LvNP + Mini Circle DNA |
| 进阶包 | 整合位点分析 + 生物分布 + 脱靶检测 | LvNP+Cas9mRNA/RNP |
| 全面包 | 进阶包 + 染⾊体SV检测 + 核型分析 | LvNP + 多靶点编辑工具/新型核酸酶 |
交付：符合IND申报要求的完整检测报告
模式三：单项服务
按需选择：Mini Circle制备、LvNP包封、脱靶检测、整合位点分析、⽣物分布检测
6、客户价值
| 维度 | 传统方案 | 舒桐 LvNP 方案 |
| 载体安全性 | 传统质粒含细菌骨架 | Mini Circle去除骨架，更安全 |
| 递送效率 | 分散对接送供应商 | LvNP递送一站式服务 |
| 安全性评估 | 多家供应商，数据分散 | 全维度评估，数据整合 |
| 项目周期 | 长（多方协调） | 短(一站式服务) |
| 数据一致性 | 不同平台，难以对比 | 统一平台，数据可溯源 |
7、为什么选择舒桐
Mini Circle制备：自主建立的Mini Circle生产平台，可提供研究级到GMP级的MC质粒
LvNP递送技术：成熟的LvNP配方开发和包封工艺，支持多种核酸类型的递送
全维度安全性评估：脱靶检测、整合位点分析、染色体安全、生物分布⼀站式覆盖
合规性支持：熟悉FDA/NMPA对体内基因治疗产品的安全性要求