Ino-seq（ABE）碱基编辑脱靶检测
Ino-seq（ABE）碱基编辑脱靶检测
1. 背景介绍
单碱基编辑技术（Base Editor, BE）作为CRISPR/Cas系统的重要衍生技术，能够在不产生DNA双链断裂（DSB）的前提下实现精准碱基转换（A·T→G·C或C·G→T·A），已成为基因治疗、作物育种等领域的核心工具[1,2]。其中，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）可修复约48%的已知致病点突变，在镰状细胞贫血、β-地中海贫血等遗传病治疗中展现出巨大的临床应用潜力[2]。
然而，ABE的脱靶效应始终是制约其临床转化的关键瓶颈——脱靶事件可能导致致癌基因激活、抑癌基因失活等非预期后果，严重威胁基因治疗产品的安全性[3,4]。ABE的脱靶效应具有双重来源：一是sgRNA依赖性脱靶，源于Cas蛋白对基因组中相似序列的容错性识别；二是sgRNA非依赖性脱靶，由脱氨酶（TadA）的内在活性导致，多在转录活跃区域或单链DNA暴露位点随机发生[1,2]。
随着监管要求日益严格，美国FDA在《基因治疗产品开发指南》中明确规定，基因治疗产品在临床前研究、临床试验及上市后监测阶段必须开展系统的脱靶效应评估[4]；中国NMPA-CDE在《体细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》中也强调了脱靶效应评估的核心地位[4]。但现有检测腺嘌呤碱基编辑器脱靶效应的方法仍存在三大主要局限：其一，依赖双链断裂中间体或 Cas9 结合事件的方法（包括 GUIDE-seq[5] 和 CHANGE-seq-BE[6]），本质上仅能检测依赖 sgRNA 的位点，无法捕获腺嘌呤碱基编辑器固有、不依赖 sgRNA 的脱氨基事件；其二，Selict-seq[2]和 Tracking-seq[7]等基于富集的方法虽直接靶向编辑产物，但灵敏度和特异性表现不稳定，可能遗漏低频编辑事件或捕获非特异性信号；其三，全基因组测序（WGS）等无偏倚检测方法不仅需要极高的测序深度（＞100×），还难以区分真实的编辑事件与背景噪声 [8-10]。
这些局限共同凸显了开发新方法的必要性 —— 需在生理相关的细胞环境中，以高灵敏度直接检测肌苷。为此，我们开发了 Ino-seq 技术，这是一种全基因组范围的脱靶位点分析方法，可直接捕获活细胞中腺嘌呤碱基编辑器作用产生的含肌苷 DNA。通过将核酸内切酶 V（EndoV）介导的肌苷切割与三种互补的降噪策略相结合，Ino-seq 能够灵敏、特异地检测依赖 sgRNA 和不依赖 sgRNA 的脱靶事件。
2. 检测原理
Ino-seq通过追踪ABE产生的脱氧肌苷（deoxyinosine, dI）实现全基因组范围内的脱靶检测（如图1）。该方法的核心原理基于核酸内切酶V（EndoV）的特异性：EndoV能够识别肌苷并在其3'端第二个磷酸二酯键处精确切割DNA。
具体流程如下：
（1）细胞经ABE处理后提取基因组DNA并进行机械打断；
（2）片段末端连接接头，经损伤修复和外切酶处理去除没有加上接头的DNA片段；
（3）EndoV在含肌苷位点特异性引入切口；
（4）热变性后，单链DNA结合蛋白（SSB）稳定单链结构，被切开的单链不带生物素，通过链霉亲和素磁珠去除未被切割的DNA片段，从而富集含肌苷的DNA；
（5）连接带独特分子标签（UMI）的桥式接头后进行PCR扩增，完成文库构建；
（6）测序时，肌苷位点固定位于P7测序引物下游第2个碱基。
图1 Ino-seq检测原理图
3. 创新与优势
3.1 核心技术创新
（1）肌苷直接捕获策略：直接靶向ABE编辑的中间产物肌苷，避免依赖DNA双链断裂或Cas蛋白结合，从原理上确保脱靶信号的特异性，富集效率达100倍以上。
（2）双脱靶类型同步覆盖：可同时检测sgRNA依赖性与非依赖性脱靶事件，彻底解决了现有方法仅能捕获单一类型脱靶的技术短板。
（3）UMI介导的高保真分析：通过唯一分子标识符（UMI）标记原始DNA片段，有效校正PCR扩增偏倚与测序错误。结合对照组背景校正算法，显著降低假阳性率，高置信度位点验证率达95%以上。
3.2 关键性能指标
与传统方法相比，Ino-seq在准确率、精确率、召回率、F1分数、AUROC、AUPRC等关键指标上均表现优异，能够高特异性地捕获真实脱靶位点（如图2）。
图2 四种ABE脱靶检测技术性能对比
4. 应用场景与服务优势
4.1 核心应用场景
（1）基因治疗产品临床前安全性评价：检测ABE在细胞系、类器官及动物模型中的脱靶效应，提供符合FDA/NMPA监管要求的脱靶检测数据，支撑IND申报资料提交[4]。
（2）碱基编辑器变体优化：对比不同BE变体（如ABE7.10、ABE8e、ABE8e (V106W)）的脱靶谱，筛选高特异性编辑器。
（3）内源性脱氨酶活性检测：评估不同细胞系/组织中内源性ADAR酶活性，为编辑策略优化提供科学依据。
（4）临床试验样本监测：跟踪临床试验中患者样本的脱靶事件动态变化，全方位保障临床应用安全。
（5）科研工具开发与验证：为新型碱基编辑技术（如高保真ABE）的脱靶特性研究提供标准化检测方案。
4.2 服务核心优势
（1）技术权威性：基于EndoV-seq等国际公认技术原理开发，性能指标来自内部核心技术文档与发明专利验证数据，技术路线严谨可靠。
（2）全面合规支持：报告体系严格遵循FDA《基因治疗产品开发指南》、NMPA《体细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》等监管要求，可直接用于IND申报与监管检查。
（3）标准化质量管理：实验室运行ISO9001质量管理体系，实验流程严格遵循SOP规范，所有数据均可溯源、可重复，符合GLP实验要求。
（4）专业技术团队：由基因编辑领域资深专家领衔，核心成员具备多年脱靶检测与数据分析经验，可提供定制化实验设计与深度结果解读。
（5）高效周期保障：标准服务周期20-30个工作日，加急服务可缩短至15个工作日，满足项目进度需求；提供中英文双语报告，适配国际申报场景。
5. 示例报告
舒桐科技提供符合监管要求的标准化Ino-seq检测报告，核心内容包括以下模块（数据为示例，实际以检测结果为准）：
（1）在靶编辑
图3 在靶位点碱基突变情况
在靶位点区域的碱基编辑情况如图3所示。图片上方标记sgRNA结合位置，上部为对照组（Blank），下部为实验组，样本上方的灰色刻度表示reads的计数。每条read以灰色条块表示，仅显示发生突变的碱基：浅蓝色表示A碱基，红色表示G碱基，深蓝色表示T碱基，橙色表示C碱基。
（2）脱靶位点检测与分类统计
图4 脱靶位点检测与分类统计
图5 在靶/脱靶位点错配图
（3）脱靶位点基因组分布与功能注释
统计所有显著脱靶位点在基因组各功能区域的占比情况，并以饼图形式展示（如图6）。
图6 脱靶位点基因功能区域注释统计
（4）安全性风险评估
对脱靶位点进行癌基因/抑癌基因注释（参考COSMIC数据库），并计算编辑频率，示例如图7所示：
图7 脱靶位点基因功能区域注释
6. 服务内容
服务流程 | 具体内容 |
项目咨询与方案设计 | 基于客户需求（编辑器类型、样本类型、研究目的）制定个性化检测方案，明确实验设计、测序深度、分析维度，提供项目报价 |
样本接收与质检 | 接收细胞、组织、基因组DNA样本，检测DNA浓度、纯度（OD260/280=1.8~2.0）与完整性（凝胶电泳验证） |
实验检测 | 按SOP完成DNA预处理、接头连接、肌苷富集、文库构建、高通量测序，全程记录实验数据 |
生物信息学分析 | 数据质控、序列比对、UMI去重、脱靶位点鉴定与分类、功能注释（癌基因/抑癌基因、基因组区域）、安全性风险评估、可视化图表生成 |
报告交付 | 提供中英文检测报告，含实验方法、原始数据、分析流程、结果解读及专家建议，附原始测序数据（FASTQ格式） |
售后支持 | 提供报告解读、数据补充分析、IND申报资料适配、技术问题答疑等持续支持 |
7. 样本要求
样本类型 | 具体要求 |
转染时间 | ·质粒：24h-96h均可，推荐48h； ·RNP：3-24 h； ·mRNA：6-24 h |
基因组DNA | ·总量≥10μg，浓度≥100ng/μL，OD260/280=1.8~2.0； ·无降解，-20℃密封保存运输 |
细胞样本 | ·细胞数量≥1×107个，无支原体污染，PBS洗涤2次后液氮速冻， ·干冰运输 |
实验分组 | ·同时提供实验组（BE处理）与阴性对照组（未处理/空载体对照） |
辅助信息 | ·提供样本类型及名称、编辑靶点信息，sgRNA+PAM序列、BE处理条件（转染时间、编辑效率） |
8. 参考文献
[1] Liang P, Xie X, Zhi S, et al. Genome-wide profiling of adenine base editor specificity by EndoV-seq[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 67.
[2] Yuan K, Xi X, Han S, et al. Selict-seq profiles genome-wide off-target effects in adenosine base editing[J]. Nucleic Acids Research, 2025, 53(7): gkaf281.
[3] Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J]. Science, 2019, 364(6437): eaaw7166.
[4] 国家药品监督管理局药品审评中心。体细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则 [Z]. 2017.
[5] Tsai S Q, Zheng Z, Nguyen N T, Joung J K, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases[J]. Nature Biotechnology, 2015, 33(2): 187-197.
[6] Lazzarotto C R, Miller S M, Kleinstiver B P. Sensitive and unbiased genome-wide profiling of base-editor induced off-target activity using CHANGE-seq-BE [J]. Nature Biotechnology, 2023, 41 (11): 1646-1653.
[7] Zhu M, Wienert B, Schaefer M, et al. Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR–Cas9-mediated genome editing[J]. Nature Biotechnology, 2024, 43(7): 799-810.
[8] Nahmad A D, Oren Y, Sorek R. Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage[J]. Nature Biotechnology, 2022, 40(12): 1807-1813.
[9] Leibowitz M L, Lee S, Kweon J, et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing[J]. Nature Genetics, 2021, 53(10): 895-905.
[10] Kosicki M, Tomberg K, Bradley A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements[J]. Nature Biotechnology, 2018, 36(8): 765-771.