转座子文库

1. 转座子背景介绍

1.1 转座子简介

转座子（Transposon）是一段能够在基因组中移动并插入到新位置的DNA序列，因其"跳跃"特性也被称为"跳跃基因"。科学家们利用这一特性，将转座子改造成强大的基因功能研究工具。

1.2 转座组成

（1）转座酶基因：编码能够识别和切割特定DNA序列的酶

（2）末端反向重复序列（ITR）：转座酶的识别位点

（3）抗性标记基因：便于筛选含有转座子的细菌

图1 舒桐转座质粒图谱

1.3 转座子分类

I型转座子：属于复制-粘贴（逆转录转座子），这类转座子通过"复制-粘贴"机制移动，先转录成RNA，再通过逆转录酶合成DNA副本，插入基因组新位置。这会增加基因组中的拷贝数。

II型转座子：属于剪切-粘贴（DNA转座子），这类转座子直接以DNA形式移动，通过"剪切-粘贴"机制从原位置切下，插入新位置。通常不会增加拷贝数。

图2 转座子分类

2. 转座子文库背景介绍

转座子文库（TransposonLibrary）是利用转座子随机插入到基因组中，创建大量突变体的技术。并在此基础上进行筛选和分析，以便研究基因的功能和基因间相互作用。

2.1 转座子文库的功能

在构建转座子文库时，转座子通常会插入到基因组的不同位置，导致基因表达的变化或破坏特定基因的功能。通过对这些突变体进行表型筛选，研究人员可以确定哪些基因与某些性状相关联，进而揭示基因的功能。

2.2 转座文库的机制

Tn5来自细菌，其机制高效且被广泛应用于高通量测序的文库构建。

(1) 组装与结合：转座酶形成一个二聚体，分别结合到转座子两端的特异性识别序列上，形成一个转座体复合物。

(2) 双链剪切与"链转移"：转座酶像一把"分子剪刀"，同时在转座子两条链的末端进行切割，产生一个双链断裂。紧接着，转座酶催化3'羟基末端直接攻击靶DNA的磷酸骨架，将转座子两端同时插入到靶位点。这个过程称为链转移。

(3) 形成缺口与修复：链转移后，在靶位点两侧的DNA链上会留下9个碱基的单链缺口。细胞内的DNA修复机制会填补这些缺口，从而在插入位点的两侧产生一个9bp的正向重复序列。这是II型转座子的标志性特征。

图3 Tn5转座系统示意图

Mariner家族转座子分布极其广泛，从昆虫到人类基因组中都存在。

(1) 识别与结合：转座酶单体识别转座子两端的反向末端重复序列并与之结合。

(2) 切割（"剪切"）：转座酶在转座子DNA的3'末端进行切割，使转座子两端各产生一个3'-OH末端。此时，转座子从原始位置被“剪切”下来。

(3) 链转移（"粘贴"）：被剪切下来的转座子和转座酶形成的复合物在基因组中寻找新的靶位点。Mariner的靶位点通常是随机的"TA"二核苷酸，转座酶在靶位点的两条链上进行交错切割（两条链的切口错开几个碱基），然后将被切下的转座子的3'-OH末端连接到靶DNA的5'-磷酸末端上。

(4)修复与形成重复：细胞修复机制会填补链转移后留下的单链缺口，最终在插入位点两侧产生一个2bp的正向重复序列。

图4 Mariner转座系统示意图

3. 转座子文库工作流程

转座子文库构建的工作流程，本质上是利用转座酶将DNA片段化与加接头两步合二为一的过程。

（1）DNA提取与质检：首先获得高质量、无降解的基因组DNA。

（2）转座酶法片段化与加接头：将DNA、转座酶和预加载有测序接头的转座体混合。转座酶会随机切割DNA，并同时将接头序列连接到切割产生的DNA片段两端。该反应在单一试管中一步完成。

（3）PCR扩增：使用与接头序列匹配的引物进行有限循环数的PCR。

（4）文库纯化与质检：使用磁珠纯化PCR产物，去除酶、引物二聚体等杂质。然后通过生物分析仪等进行质量检测，确认文库的片段大小分布和浓度是否符合预期。

（5）上机测序：将合格的不同文库按比例混合，进行高通量测序。

该技术的最大优势在于：将传统的片段化→ 末端修复→ 加A尾 → 连接接头等多步操作，简化为一个单管反应，极大缩短了操作时间（从数小时缩短至数分钟），并减少了样本损失和人为误差，是目前高通量测序文库构建的主流方法。

图4 转座子插入测序工作流程

a | 构建一个高密度转座子插入文库，确保每个非必需基因位点都存在多个插入突变。b | 将测序序列比对至基因组，通过统计分析每个插入位点的读数计数，确定在选择性生长条件下显著缺失的基因组位点。

Tn-seq技术利用转座子两端的反向重复序列（ITR）作为特异性分子标签，通过高通量测序实现插入位点的精确定位与定量分析，从而系统性解析基因功能。

图5 Tn-seq检测原理示意图

4. 舒桐生物提供服务

舒桐提供一站式转座子文库服务，全面覆盖从质粒转化细菌、转座酶发生转座、文库菌株构建、Tnseq测序、数据分析的全流程，助力客户高效开展功能基因组学研究。利用高效的转座子系统，我们可在多种细菌物种中构建高质量的随机突变体文库，确保突变均匀覆盖整个基因组，并通过高通量测序精准评估突变分布。

舒桐成功助力多种工业及环境微生物的转座子文库构建与TnSeq分析领域，提供成熟的一站式服务。覆盖菌株包括：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、芽孢杆菌及恶臭假单胞菌等。

（1）一站式文库构建：我们整合了从细菌转化到突变体文库构建的完整流程，采用先进转座子技术，确保构建的文库具有高覆盖度和均匀性，满足多样本需求。

（2）无缝Tn-seq测序：在文库构建基础上，我们提供一站式的Tn-seq测序服务，高效鉴定突变株插入位点，快速建立表型筛选与基因背景的关联分析，揭示特定突变的功能影响。

（3）全面基因组覆盖：我们的转座子文库系统覆盖整个细菌基因组，确保突变体多样性，为深入研究基因功能和基因间相互作用提供坚实基础。

（4）严格质量控制：从文库构建到测序，我们执行严格的质量控制步骤，包括片段大小分析和浓度验证，确保每一步都符合高通量测序的高标准。

（5）定制化解决方案：根据您的特定需求，我们可定制转座子插入位点和测序策略，无论是模式生物还是复杂细菌系统，都能灵活适配。

（6）深度数据分析：作为一站式服务的重要组成部分，我们不仅提供文库构建和测序，还配套专业的数据分析支持，帮助客户深入解读Tn-seq结果，挖掘基因功能与表型关联。通过舒桐的一站式转座子文库服务，您可以从细菌转化、文库构建、Tnseq测序到数据分析，全程无忧，加速功能基因组学研究进程。