PEM-seq染色体重排易位检测
PEM-seq染色体重排易位检测
1. 背景介绍
随着CRISPR等基因编辑技术在基因治疗领域的广泛应用，其潜在的安全性风险日益受到各国监管机构的高度重视。CRISPR切割产生的双链DNA断裂（DSB）在修复过程中可能导致染色体重排易位事件，包括染色体大片段缺失、外源DNA片段插入以及染色体易位。美国食品药品监督管理局（FDA）已明确强调了对染色体重排易位检测的重要性，因为这些事件可能导致严重的不良反应，包括基因组不稳定性增加、遗传疾病风险增加、治疗失败以及其他不可预测的后果[1-4]。
图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》安全性评估关于染色体结构异常检测的指导
舒桐科技2022年推出的Primer-Extension-Mediated sequencing（PEM-seq）染色体重排易位检测平台，基于NGS技术实现对多种基因编辑诱导的基因组结构变异精准量化。为确保技术的可靠性与准确性，舒桐科技团队依照ICH Q2(R1)指导原则及FDA《生物分析方法验证：行业指南》，开展了系统的方法学验证，建立了完整的技术评估体系。舒桐科技目前已成功为多家国内外基因治疗企业提供符合监管标准的基因编辑安全性评估服务，全方位支持IND申报及临床转化。
2. PEM-seq检测原理
PEM-seq技术是一种高灵敏度的染色体重排易位检测方法，可精确检测基因编辑引起的染色体重排事件[4]。其原理是通过在DSB上游或下游设计引物（诱饵primer），捕获与DSB位点DNA修复后连接的序列（猎物序列）。详细的检测步骤包括：
1. 将基因组DNA超声片段化至300-700bp大小；
2. 使用距离cut-site 50~110bp的生物素化引物进行线性延伸；
3. 通过链霉亲和素磁珠捕获并富集生物素标记的单链DNA；
4. 在末端与含有随机分子条码的接头连接，实现后续目标片段的指数扩增；
5. 使用I5-Nested和I7引物进行巢式PCR后再使用带有独特索引的Illumina接头引物进行文库扩增；
6. 通过高通量测序技术对文库进行测序，分析目标区域的序列变异。
图2 PEM-seq检测原理示意图
3. PEM-seq检测与分析优势
3.1 全面精准检测多种基因编辑重排事件
PEM-seq技术可高效检测以下几类基因编辑产生的染色体重排事件：
1. 单靶点编辑重排：精确检测单个cut-site周围的大片段缺失、插入及与其他基因组位点的易位；
2. 多靶点编辑重排：量化多靶点同时编辑时不同on-target位点间的染色体重排风险；
3. 脱靶位点重排：识别脱靶切割位点与在靶位点或其他基因组位点间的重排易位事件；
4. 背景DSB易位检测：检测由DNA复制或其他物理化学因素产生的背景DSB与编辑位点间的易位事件。
3.2 卓越的检测性能
舒桐科技严格遵循ICH Q2(R1)[1]及FDA生物分析方法验证指南[2]，从四个关键维度对PEM-seq技术进行全面系统验证：
验证参数 | 验证结果 |
准确性 | 在50%~0.001%浓度梯度下，阳性标准品检出率达100% |
精密度 | 六个浓度梯度样本三次重复检测CV值最低为1.30%，表现优异稳定性 |
线性范围 | 0.001%~50%浓度范围内检测结果与理论值线性相关性R²>0.99 (P<0.05) |
灵敏度 | 最低定量限(LLOQ)达0.001%，100,000个正常细胞中可精确检出单个异常细胞 |
3.3 服务优势
1. 方法学验证完善：PEM-seq已通过系统性验证，具备0.001%-50%全线性范围的高灵敏度和特异性；
2. 监管合规保障：严格遵循ICH Q2(R1)及FDA指南要求，确保检测结果符合国际监管标准；
3. 技术平台领先：PEM-seq可全面检测基因编辑引起的多种染色体结构变异事件，包括染色体易位（Translocation）、大片段缺失（Deletion）、插入（Insertion）以及倒位（Inversion）等[5]，满足药物研发各阶段安全性评估需求；
4. 成功案例丰富：已成功为优赛诺等多家基因治疗企业提供服务，协助产品顺利完成IND申报；
5. 定制化分析方案：根据靶点特性提供定制方案，出具包含准确性、灵敏度、重复性及线性范围等关键指标的完整分析报告；
6. 全流程服务模式：从靶点安全性预评估、样本检测到IND申报数据支持，提供全流程基因编辑安全性解决方案。
4. PEM-seq检测应用场景
4.1 PEM-seq技术应用领域
1. 靶点筛选阶段安全性评估：提供分子水平的重排易位风险量化，帮助研发团队筛选最优靶点；
2. sgRNA设计优化：评估不同sgRNA的染色体重排风险，选择安全性最佳的序列设计；
3. 临床前安全性评价：满足监管机构对基因编辑药物染色体重排风险评估的严格要求；
4. IND申报数据支持：提供符合ICH和FDA要求的方法学验证报告和安全性评估数据；
5. 临床样本监测：用于临床试验中患者样本的基因编辑安全性监测；
6. 生产质量控制：作为基因治疗产品放行的质量控制关键指标。
4.2 成功案例
舒桐科技已持续为优赛诺、启函、邦耀等企业提供全流程的基因编辑安全性评估服务，包括PEM-seq检测、数据分析及监管文件准备，协助其CAR-T产品顺利完成FDA的IND申报并获得监管认可。此外，我们还为多家国内外基因治疗企业提供了基因编辑安全性评估服务，支持多个产品的IND申报和临床研究。
5. PEM-seq检测报告示例
舒桐科技提供的PEM-seq分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与实验原理介绍、PEM-seq技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息（包括样本ID、实验/对照组分类、sgRNA序列及基因组坐标）、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：
（1）DSB位点编辑事件统计：提供全面的DSB位点编辑事件统计，包括Germline（未编辑）、Substitution（碱基替换）、Deletion（缺失）、Insertion（插入）、Inversion（倒位）及Translocation（易位）等各类编辑事件的精确统计与比例分析。通过直观的可视化图表展示各类编辑事件在染色体上的分布情况。
图3 PEM-seq示例报告：捕获的DSB位点编辑事件的统计（左）和在靶位点reads的可视化（右）
（2）染色体易位事件精准定量：对易位和倒位事件按事件类型（On-target+On-target、On-target+Off-target以及On-target+Background）进行分类统计，详细记录事件发生的染色体位置、切割位点、涉及的基因区域和功能影响。同时还提供基因功能影响注释，通过饼图和表格直观展示不同功能影响类型的分布及高频事件，为评估基因编辑对细胞功能的潜在影响提供科学依据。
图4 PEM-seq示例报告（易位和倒位事件统计及分类）
（3）脱靶位点鉴定与评估：采用专业算法对潜在脱靶位点进行系统鉴定与评估，提供脱靶位点的染色体坐标、序列比对、功能注释及基因组分布可视化（Circos图），全面分析基因编辑的特异性及潜在的脱靶风险，为基因治疗产品的安全性评价提供关键技术支持。
图5 PEM-seq示例报告（脱靶易位位点鉴定）
6. PEM-seq检测服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询与评估 | 评估靶点特性，制定个性化检测方案，进行项目报价 |
样本接收与质检 | 严格按标准对样本进行全面质检，确保符合建库要求 |
引物设计与验证 | 在切割位点上/下游50~110bp区域设计高特异性引物并验证 |
PEM-seq专业建库 | 执行标准化建库流程：样本片段化、引物延伸、目标捕获及文库扩增 |
高通量测序 | 文库质检合格后进行PE150测序，确保数据质量 |
生物信息学分析 | 编辑事件统计、染色体易位定量、脱靶位点鉴定及功能注释 |
专业报告交付 | 提供标准化分析报告，含技术解读与咨询服务 |
IND申报支持 | 可按客户需求提供符合ICH Q2(R1)和FDA要求的方法学验证报告 |
*服务周期：标准流程20-30个工作日；
*服务特色：可提供从sgRNA设计到结果分析的一体化服务支持。
7. PEM-seq检测样本要求
类别 | 具体要求 |
基础服务选项 | ·可免费设计sgRNA并构建质粒； ·可提供转染及后续建库测序服务（客户需提供细胞系）； ·可单独提供建库测序服务（客户需提供合格DNA样本）。 |
DNA样本标准 | ·总量：基因编辑后DNA Qubit定量≥40ug/位点(双端检测)； ·浓度：≥50ng/μL； ·纯度：OD260/280=1.8~2.0； ·完整性：无降解（需提供凝胶电泳检测图）。 |
实验分组要求 | ·建议同时提供实验组和对照组样本 |
客户需同时提供样本信息 | ·样本类型及名称； ·编辑靶点信息； ·sgRNA序列和PAM序列； ·切割位点坐标（含上下游500bp序列）； ·编辑类型说明（单靶点/多靶点）。 |
增值服务 | ·一体化服务（从靶点设计到数据分析）； ·个性化分析（根据项目需求定制）； ·监管申报技术支持。 |
*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送细胞渣样本用于DNA提取，细胞渣要求>2×107/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] 国际人用药品注册技术协调会. (2005). ICH三方协调指导原则：分析方法论证：正文和方法学 Q2(R1) [现行第4阶段版本].
[2] 美国食品药品监督管理局. (2018年5月). 生物分析方法验证：行业指南. 美国卫生与公共服务部食品药品监督管理局药品评价和研究中心与兽医药品中心.
[3] Hu J, et al. Detecting DNA double-stranded breaks in mammalian genomes by linear amplification-mediated high-throughput genome-wide translocation sequencing. Nat Protoc 11, 853-871, doi:10.1038/nprot.2016.043 (2016).
[4] Yin J, et al. Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell Discov 5, 18, doi:10.1038/s41421-019-0088-8 (2019).
[5] Yin L, et al. Cas9 exo-endonuclease eliminates chromosomal translocations during genome editing. Nat Commun 13, 1204, doi:10.1038/s41467-022-28900-w (2022).