JCI | 宫颈癌首个全基因组蛋白基因组学图谱出炉 多组学测序锁定靶点，珠海舒桐CRISPR敲除完成体内外验证
本文三大核心看点
多组学测序建图：139例肿瘤-正常配对，WGS + 转录组 + 蛋白组 + 磷酸化蛋白组四维整合，鉴定10,037个蛋白、32,767个磷酸化位点，构建宫颈癌首个全基因组蛋白基因组学图谱。
珠海舒桐完成CRISPR筛选锁定致死靶点：结合大规模CRISPR功能筛选数据（DepMap），整合基因必要性评分与蛋白预后数据，精准锁定C2亚型"致命要穴"MFAP1和SF3B5。
珠海舒桐完成CRISPR/Cas9敲除验证：从sgRNA设计到裸鼠体内荷瘤，全流程验证三个靶点（MFAP1、SF3B5、KRT16）的功能必要性，以共同作者单位署名发表。
01
宫颈癌急需蛋白质层面的系统解析
宫颈癌（CC）是全球女性第四大癌症死亡原因，每年超过30万人死亡，仅亚洲就约20万。对于转移或复发患者，现有治疗方案的五年生存率仅15–20%。过去十年，基因组研究极大推进了对宫颈癌遗传变异的认知，但基因层面的改变能否最终体现为蛋白质功能变化，决定着靶点是否真正可用。
蛋白基因组学（Proteogenomics）正是弥合这一鸿沟的关键——将基因组、转录组与蛋白质组联合分析，从而识别真正驱动肿瘤的功能性分子靶点。本研究正是宫颈癌领域此类系统研究的首次尝试。
02
四组学联合测序
一张139例样本的宫颈癌分子全景图
2.1 研究设计与样本规模
研究团队前瞻性收集2014–2019年武汉中心医院及同济医院的治疗前宫颈癌标本，构建迄今规模最大的宫颈癌多组学数据集：
130例肿瘤/配对血液：全基因组测序（WGS，2×150 bp，Illumina HiSeq X）
101例肿瘤：RNA测序（RNA-seq，DNBSEQ-T7平台）
139对肿瘤/癌旁正常组织（NAT）：全蛋白质组学 + 磷酸化蛋白质组学（LC-MS/MS，Spectronaut v18.0）
图1（原文Figure 1） 研究框架及基因组、蛋白组、磷酸化蛋白组全景概览
2.2 基因组层面：高频突变与广泛基因组不稳定
WGS分析揭示高频突变基因：PIK3CA（25%）、KMT2C（11%）、SYNE2（7%）、KMT2D（6%）等为主要驱动突变。结构变异层面，16%样本发生全基因组加倍（WGD），27%存在染色体碎裂（chromothripsis），82%的肿瘤含有≥2个克隆亚群，揭示宫颈癌的高度基因组不稳定性和瘤内异质性。
新发现拷贝数变异（CNA）驱动基因：在已知热点之外，研究首次发现1p34.2（MYCL）、9p23（NFIB）、21p12（ICOSLG）等新型复发性拷贝数增益，以及6p22.1（HLA-A）复发性缺失。其中，RABIF拷贝数增益可通过调控RAB10蛋白水平促进葡萄糖摄取，驱动肿瘤生长，并与患者预后不良独立相关（OS: HR = 2.125, P = 0.04）。
2.3 蛋白质组层面：肿瘤免疫抑制与RNA代谢异常激活
蛋白质组分析共鉴定10,037个蛋白。与癌旁正常组织相比：
下调蛋白（1,041个）集中富集于补体激活和体液免疫通路——揭示宫颈癌肿瘤微环境的系统性免疫抑制。
上调蛋白（1,706个）高度富集于RNA代谢、核糖核蛋白复合物生物发生、翻译和RNA剪接通路。
23个蛋白在≥90%肿瘤中呈高倍上调（>1.5 Log2 FC），其中TACSTD2、TFRC、TYMP已有FDA批准药物靶向，具有直接临床转化潜力。
2.4 磷酸化蛋白质组层面：磷酸化事件大规模扩增
磷酸化蛋白质组分析鉴定32,767个磷酸化位点，覆盖6,364个磷蛋白（位点定位可信度>0.75）。肿瘤中磷酸化位点数量显著多于配对正常组织（P = 4.53×10⁻¹⁴），磷酸化富集通路同样以RNA加工为主。分析发现13个具有独立预后价值的磷酸化位点，其中NUCKS S181磷酸化水平升高与总生存期缩短最为显著相关（P = 0.003），而对应的蛋白总量并无相似预后关联——凸显磷酸化蛋白质组在预后标志物发现中的独特价值。
2.5 四大分子亚型：多组学整合聚类的直接产物
基于转录组和蛋白组数据，研究利用SNF-CC无监督聚类将101例宫颈癌患者划分为四大蛋白基因组分子亚型：
C1（EMT型）：富集胞外基质重塑和伤口愈合通路，纤维细胞和内皮细胞丰富，侵袭性强。
C2（增殖型）：RNA加工通路高度上调，增殖评分最高，预后最差（OS和PFS均显著劣于其他亚型）。
C3（免疫应答型）：免疫评分最高，CD8+ T细胞浸润丰富，免疫检查点高表达——对PD-1/CTLA-4双免疫阻断治疗响应率高达90%（非C3亚型仅18%，P = 0.002）。
C4（上皮分化型）：高角蛋白表达，淋巴管侵犯（LVSI）频率最高。
03
珠海舒桐完成CRISPR筛选
从多组学候选基因中精准锁定功能致死靶点
本研究CRISPR功能筛选分析由珠海舒桐团队合作完成。
多组学分析虽能鉴定大量"差异表达"候选基因，但哪些基因是肿瘤细胞生存真正不可或缺的，需要功能筛选数据来回答。珠海舒桐团队引入DepMap大规模CRISPR功能筛选数据库的基因必要性评分，构建了"三重叠加"优先化筛选策略，专门针对预后最差的C2增殖亚型：
筛选层一：C2亚型中蛋白高表达（vs.其他三种亚型），筛出435个候选蛋白。
筛选层二：DepMap CRISPR敲除细胞系中基因必要性评分 < −0.7（即敲除该基因导致细胞系显著死亡）。
筛选层三：高表达与患者总生存期缩短独立相关，具有预后价值。
三层过滤后，两个核心靶点脱颖而出：
MFAP1（必要性评分：−1.66）—— 核心剪接体组分，参与mRNA前体剪接
SF3B5（必要性评分：−3.21）—— 必要性评分极低，高度依赖
同样的策略在C4上皮分化亚型中识别出KRT16（角蛋白16）作为特异性候选靶点。
图2（原文Figure 4） 各亚型基因必要性评分分布及MFAP1、SF3B5在C2亚型中的预后相关性，基因必要性评分越低，说明DepMap CRISPR筛选中敲除该基因对肿瘤细胞的致死效果越强。
珠海舒桐的贡献：通过整合DepMap CRISPR筛选数据、蛋白质组差异表达数据与患者预后信息，珠海舒桐团队将候选靶点从"统计层面的高表达"升级为"功能层面的生存必需"，为后续体内外敲除验证提供了最充分的科学依据。
04
珠海舒桐完成CRISPR/Cas9敲除验证
细胞到动物，全流程功能确认
本研究CRISPR筛选分析与CRISPR/Cas9功能验证实验由珠海舒桐合作完成，并以共同作者单位署名发表于JCI。
珠海舒桐团队针对三个靶点（MFAP1、SF3B5、KRT16）完成了从sgRNA设计到体内肿瘤模型的全链条实验验证：
4.1 sgRNA设计与敲除效率验证
针对每个靶基因设计两条独立sgRNA序列，通过慢病毒系统在C2代表细胞系SiHa（MFAP1/SF3B5）和C4代表细胞系ME-180（KRT16）中构建稳定敲除细胞系。Western blot确认三个靶基因蛋白水平均实现高效敲除，打乱序列（Scramble）作为对照，保证实验可靠性。
4.2 克隆形成实验：体外增殖能力丧失
在稳定敲除细胞系中进行克隆形成实验：MFAP1、SF3B5敲除后，SiHa细胞克隆形成数量显著减少；KRT16敲除后，ME-180细胞同样出现克隆形成能力的显著下降。与各自的Scramble对照组相比，差异均具有统计学显著性（n = 3, one-way ANOVA）。体外实验直接证明三个靶基因对宫颈癌细胞增殖不可或缺。
4.3 裸鼠皮下荷瘤实验：体内肿瘤生长被有效抑制
将敲除细胞系接种于裸鼠皮下（每组n = 5只），定期测量肿瘤体积，随访至实验终点：
MFAP1敲除组：肿瘤体积及生长速率均显著低于对照组（two-way ANOVA）
SF3B5敲除组：肿瘤抑制效果更为突出，与其极低的必要性评分（−3.21）一致
KRT16敲除组：ME-180来源的裸鼠荷瘤生长同样受到显著抑制
体内实验将功能必要性从"细胞层面"推进至"整体动物层面"，有力支撑了靶点的临床转化价值。
4.4 机制延伸：MFAP1通过RBM4-mTORC1轴驱动肿瘤
对MFAP1敲除细胞进行RNA测序与剪接分析（rMATS）显示：MFAP1缺失导致RBM4基因第3外显子inclusion比例增加，短转录本RBM4-S减少，进而抑制mTORC1通路（S6K磷酸化水平下降）。这一机制发现揭示了MFAP1通过剪接体依赖性机制调控mTORC1致癌信号的新路径，为开发联合靶向策略提供了理论依据。
图3（原文Figure 5，CRISPR/Cas9敲除实验由珠海舒桐完成） H/K/Q：Western blot验证MFAP1、SF3B5、KRT16敲除效率； I/L/R：克隆形成实验——三靶点敲除均显著抑制细胞体外增殖； J/M/S：裸鼠荷瘤实验——三靶点敲除均显著抑制体内肿瘤生长。
珠海舒桐在本项目中的完整贡献：
【CRISPR筛选分析】整合DepMap基因必要性评分 + 蛋白质组差异表达 + 患者预后数据，构建三重叠加优先化策略，锁定MFAP1、SF3B5、KRT16三个靶点。
【CRISPR/Cas9敲除验证】sgRNA设计与合成 → 慢病毒包装与细胞转导 → 稳定敲除细胞系构建 → Western blot敲除效率验证 → 克隆形成体外功能实验 → 裸鼠皮下荷瘤体内功能验证 → 实验数据整理与图表制作 → 以共同作者单位（Generulor Company Bio-X Lab）署名发表于JCI。
05
多组学建图 + CRISPR功能验证，精准靶向宫颈癌的完整闭环
本研究展示了一条从"多组学海量数据"到"功能验证靶点"的完整转化路径：
WGS + 转录组 + 蛋白组 + 磷酸化蛋白组 → 建立宫颈癌分子全景图
蛋白差异表达 + DepMap CRISPR必要性评分 + 预后数据整合 → 优先化候选靶点（由珠海舒桐完成）
CRISPR/Cas9敲除（细胞体外 + 动物体内）→ 功能验证靶点必要性（由珠海舒桐完成）
剪接分析 + 信号通路检测 → 明确靶点作用机制
最终，MFAP1和SF3B5被确立为宫颈癌C2增殖亚型的功能必需基因，KRT16为C4亚型的验证治疗靶点，四蛋白分类器（CDH13/TP53BP1/NNMT/HSPB1）为免疫治疗患者筛选提供了实用工具。
GeneRulor
CRISPR文库筛选服务
如本研究中珠海舒桐独立承担的CRISPR功能筛选分析工作，我们提供全基因组CRISPR敲除文库（GeCKO、Brunello等主流文库）及覆盖激酶、RNA结合蛋白、转录因子等特定基因集的定制化靶向文库。支持CRISPRi（基因干扰）、CRISPRa（基因激活）文库及Perturb-seq（单细胞CRISPR筛选）方案，覆盖2D细胞系、3D类器官及体内多场景。
CRISPR/Cas9基因敲除服务（含体内外功能验证）
如本研究中珠海舒桐完成的工作，我们提供sgRNA设计→慢病毒包装→稳定敲除细胞系构建→Western blot验证→克隆形成/增殖实验→裸鼠荷瘤体内验证的全流程一体化服务。单/多基因敲除均可实现，编辑效率稳定≥95%，支持2D细胞系、3D类器官及原代细胞多种模型。实验数据可直接用于发表。
多组学测序与生物信息分析
支持转录组（RNA-seq）、蛋白质组（DIA/DDA）、磷酸化蛋白质组及CRISPR筛选高通量测序的数据分析，包括基因必要性评分整合（DepMap）、激酶活性分析（KSEA）、蛋白互作网络、生存分析及多组学联合靶点优先化评分，从数据到可发表图表一站式交付。
欢迎垂询合作，共同推动精准肿瘤学研究！
参考文献
Tian X, Li M, Wang Z, et al. Proteogenomic characterization of cervical cancer identifies molecular subtypes predictive of clinical outcomes and subtype-specific targets. J Clin Invest. 2026. https://doi.org/10.1172/JCI199497