二代Long range PCR大片段删除检测
二代Long range PCR大片段删除检测
1. 二代Long-range PCR检测技术背景介绍
随着CRISPR等基因编辑技术在基因治疗领域的广泛应用，其潜在的安全性风险日益受到各国监管机构的高度重视。CRISPR切割产生的双链DNA断裂（DSB）在修复过程中可能导致染色体重排易位事件，包括染色体大片段缺失、外源DNA片段插入以及染色体易位。美国食品药品监督管理局（FDA）已明确强调了对染色体重排易位检测的重要性，因为这些事件可能导致严重的不良反应，包括基因组不稳定性增加、遗传疾病风险增加、治疗失败以及其他不可预测的后果。
图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》安全性评估关于染色体结构异常检测的指导
舒桐科技推出的二代Long-range PCR染色体重排检测平台，专为全面检测基因编辑后的多种结构变异事件而设计，包括大片段缺失(≥50bp)、小片段缺失(<50bp)和各种大小的插入事件。该技术通过在切割位点上下游约5kb处设计特异性引物，扩增跨越切割位点的长片段DNA(约10kb)，结合高通量测序(NGS)技术，能够全面捕获和精确量化各类编辑事件。与PEM-seq等技术互为补充，二代Long-range PCR技术弥补了在大片段缺失检测方面的局限性，为基因治疗产品的安全性评估提供全面可靠的数据支持。
2. 二代Long-range PCR检测原理
二代Long-range PCR是一种专门针对基因编辑后大片段缺失事件的高灵敏度检测方法。其核心原理是通过在目标切割位点(cut-site)上下游约5kb处设计特异性引物，扩增跨越切割位点的长片段DNA(约10kb)，从而有效捕获包括大片段缺失(≥50bp)、小片段缺失(<50bp)和各种大小的插入事件在内的各类基因编辑产物。详细的检测步骤包括：
1. 在切割位点(cut-site)上下游约5kb处设计特异性引物，覆盖约10kb的基因组区域；
2. 使用高保真长片段PCR聚合酶对基因编辑后的DNA样本进行特异性扩增；
3. 将纯化回收的长片段PCR产物进行超声随机打断处理；
4. 对打断后的DNA片段进行常规文库构建；
5. 通过高通量测序技术对文库进行深度测序；
6. 应用专业生物信息学分析流程，精确检测并量化各类结构变异事件。
图2 二代Long-range PCR实验流程
3. 二代Long-range PCR检测优势
3.1 全面捕获多种基因编辑事件
相比于其他技术，二代Long-range PCR技术在结构变异检测方面具有显著优势：
1. 检测范围全面：可同时检测大片段缺失(≥50bp)、小片段缺失(<50bp)和各种大小的插入事件；
2. 捕获率高：通过特异性引物直接扩增目标区域，提高各类结构变异事件的捕获效率；
3. 定量准确：结合高通量测序技术，实现对各类缺失和插入事件的精确定量；
4. 差异化扩增优势：PCR扩增过程中，含大片段缺失的DNA片段相对更短，扩增效率更高，有利于低频缺失事件的检出；同时对插入事件也具有良好的捕获能力。
3.2 技术互补性
FDA已明确指出，PEM-seq技术由于引物设计距离切割位点较近(50-110bp)，可能无法有效检测引物区域以外的大片段缺失事件，存在检测盲区。二代Long-range PCR技术通过在切割位点远端(约5kb处)设计引物，有效弥补了这一技术局限，能够全面检测各类缺失和插入事件，与PEM-seq形成互补，共同构建完整的基因编辑安全性评估体系。
3.3 服务优势
1. 全面结构变异分析：同时提供大片段缺失、小片段缺失和插入事件的全面检测与分析；专业引物设计：针对不同编辑位点提供个性化引物设计，确保扩增特异性和覆盖率；
2. 标准化流程：从样本处理到文库构建，全程采用标准化流程，确保结果可靠性；
3. 深度测序：采用高通量测序平台进行深度测序，提高低频变异的检出灵敏度；
4. 专业数据分析：应用CRISPR-LargeDel等专业软件进行数据分析，过滤假阳性，提供准确的编辑效率量化；
5. 完整报告交付：提供包括各类缺失和插入事件统计、功能注释等在内的全面分析报告；
6. 监管合规保障：符合FDA等监管机构对基因编辑安全性评估的技术要求，支持IND申报。
4. 技术应用场景
4.1 应用领域
1. 全面安全性评估：量化基因编辑产生的各类结构变异事件(缺失和插入)，评估潜在安全风险；
2. 靶点筛选优化：比较不同靶点或sgRNA设计的结构变异模式和风险，选择最优编辑策略；
3. 编辑效率评价：精确量化不同类型编辑事件的比例，全面评估基因编辑效率；
4. IND申报支持：提供符合监管要求的基因编辑安全性评估数据，支持药物研发各阶段需求；
5. 质量控制：作为基因治疗产品的关键质控指标，确保产品安全性。
4.2 与PEM-seq技术的互补应用
二代Long-range PCR技术与PEM-seq技术互为补充，共同构成全面的基因编辑安全性评估体系：
1. PEM-seq：专注于染色体易位事件检测，可鉴定基因编辑引起的染色体重排、易位及脱靶切割位点；
2. 二代Long-range PCR：专注于各类缺失(大片段≥50bp和小片段<50bp)和插入事件的检测，弥补PEM-seq在结构变异检测方面的局限性。
3. 舒桐科技推荐在基因编辑安全性评估中同时采用这两种技术，以获取最全面的基因组结构变异数据。
4.3 成功案例
舒桐科技已持续为优赛诺、上海沙砾等企业提供全流程的基因编辑安全性评估服务，包括二代Long-range PCR检测、数据分析及监管文件准备，协助其CAR-T产品顺利完成IND申报并获得监管认可。此外，我们还为多家国内外基因治疗企业提供了基因编辑安全性评估服务，支持多个产品的IND申报和临床研究。
5. 二代Long-range PCR检测报告内容
舒桐科技提供的二代Long-range PCR分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景介绍、二代Long-range PCR技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息（包括样本名称、实验/对照组分类、sgRNA序列及基因组坐标、引物序列等信息）、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：
（1）实验组和对照组Large Deletion事件统计：全面统计实验组和对照组大片段缺失(≥50bp)事件，展示不同长度范围的缺失事件（50-100bp、100-200bp、200-1000bp、≥1000bp）占比情况，并提供通过对照组过滤去除假阳性后每个实验组样本的⼤⽚段缺失情况。
图3 二代Long-range PCR示例报告（实验组和对照组Large Deletion事件统计）
图4 二代Long-range PCR示例报告（实验组去除假阳性后的Large Deletion事件）
（2）大片段缺失大小分布可视化：通过缺失大小分布图和对称性分布图直观展示缺失事件与切割位点的相对位置关系。
图5 二代Long-range PCR示例报告（大片段缺失频率大小分布图）
图6 二代Long-range PCR示例报告（大片段缺失分布性对称图）
（3）大片段缺失事件特征与注释：对大片段缺失事件进行详细的特征分析与基因注释，包括染色体位置、缺失大小、与切割位点的距离以及涉及的基因区域。
图7 二代Long-range PCR示例报告（大片段缺失事件特征与注释）
（4）大片段缺失事件影响注释：对大片段缺失事件的功能影响进行深入评估，包括transcript_ablation、frameshift_variant等变异类型的注释，并按照HIGH、MODERATE、LOW等级别对影响程度进行分类，特别关注对肿瘤抑制基因（TSG）等功能基因的潜在影响。
图8 二代Long-range PCR示例报告（大片段缺失事件影响注释）
（5）小片段插入缺失（Small Indel）事件分析：精确统计实验组和对照组中小片段缺失(<50bp)和各种大小插入事件的分布情况，将小片段缺失细分为1-20bp和20-50bp两个区间，插入事件细分为1-10bp、10-20bp和≥20bp三个区间，全面展示小片段编辑事件的模式和频率。通过剔除对照组中检测到的背景事件，精确计算实验组中真实的小片段插入缺失频率，为评估基因编辑的精确度和效率提供可靠数据支持。
图9 二代Long-range PCR示例报告（过滤前后小片段插入缺失事件分析）
6. 二代Long-range PCR检测服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询与评估 | 评估靶点特性，设计最佳引物策略，制定个性化检测方案，进行项目报价 |
样本接收与质检 | 严格按标准对样本进行全面质检，确保符合建库要求 |
引物设计与筛选 | 在切割位点上下游约5kb处设计多对引物并筛选最优引物对 |
Long-range PCR扩增 | 使用高保真聚合酶进行长片段PCR扩增，捕获各类编辑事件 |
文库构建与质检 | 超声打断PCR产物，进行常规文库构建及质量控制 |
高通量测序 | 对合格文库进行PE150测序，确保数据质量和深度 |
生物信息学分析 | 使用专业软件分析大片段缺失、小片段缺失及各类插入事件 |
专业报告交付 | 提供标准化分析报告，含技术解读与咨询服务 |
IND申报支持 | 可提供符合监管要求的技术支持及方法学验证 |
*服务周期：标准流程20-30个工作日；
*服务特色：可提供从sgRNA设计到结果分析的一体化服务支持。
7. 样本要求
类别 | 具体要求 |
基础服务选项 | ·可免费设计sgRNA并构建质粒； ·可提供转染及后续建库测序服务（客户需提供细胞系）； ·可单独提供建库测序服务（客户需提供合格DNA样本）。 |
DNA样本标准 | ·总量：DNA Qubit定量≥250ng/位点； ·浓度：≥20ng/μL； ·纯度：OD260/280=1.8~2.0； ·完整性：无降解（需提供凝胶电泳检测图）。 |
实验分组要求 | ·需同时提供实验组和对照组样本 |
客户需同时提供样本信息 | ·样本类型及名称； ·编辑靶点信息； ·sgRNA序列和PAM序列； ·切割位点坐标； ·编辑类型说明（单靶点/多靶点）。 |
增值服务 | ·一体化服务（从靶点设计到数据分析）； ·个性化分析（根据项目需求定制）； ·监管申报技术支持。 |
*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送细胞渣样本用于DNA提取，细胞渣要求>1×106/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] Jia H, Guo Y, Zhao W, Wang K. Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer. Sci Rep. 2014;4:5737.
[2] Keith. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2021;523:481-485.
[3] Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2015;33(2):187-197.
[4] Jia H, Guo Y, Zhao W, Wang K. Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer. Sci Rep. 2014;4:5737.
[5] Hwang, G. H., Lee, S. H., Oh, M., Kim, S., Habib, O., Jang, H. K., ... & Bae, S. (2024). Large DNA deletions occur during DNA repair at 20-fold lower frequency for base editors and prime editors than for Cas9 nucleases. Nature Biomedical Engineering.
[6] Kosicki, M., Tomberg, K. & Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR--Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat Biotechnol 36, 765--771 (2018).