液相杂交捕获脱靶位点验证

液相杂交捕获脱靶位点验证

1. 背景介绍

根据最新发布的FDA基因治疗产品指南文件（2024年1月），对于人类基因组编辑的基因治疗产品安全性评估，监管机构明确提出了全面的要求。该指南特别强调了对脱靶编辑事件的识别和验证的重要性，包括类型、频率和位置的全面分析。监管要求指出："验证脱靶位点应采用具有足够灵敏度的方法来检测低频率事件"，并且通过软件预测、GUIDE-seq细胞水平检测、AID-seq体外生化检测三种维度鉴定的脱靶位点均需进行验证，且验证须在至少3个独立donor样本中开展，并匹配未编辑对照组以过滤背景突变。

图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》安全性评估关于脱靶验证的指导

在这一监管背景下，液相杂交捕获脱靶验证作为一种全基因组范围无偏见的脱靶检测方法应运而生。与扩增子脱靶验证需要针对每个潜在位点单独设计引物和单次建库不同，液相杂交捕获技术通过设计覆盖全基因组潜在脱靶区域的探针系统，在单次反应中能够同时捕获数百至数千个潜在脱靶位点，大幅提高了检测效率和全面性，一般作为一个初筛的手段进行高效的验证，最快速筛选出高频脱靶位点（编辑效率≥0.2%），满足监管部门的要求。

2. 液相杂交捕获脱靶验证原理

液相杂交捕获（TES）检测的基本原理是基于碱基互补配对的原则，通过设计一组覆盖目标序列的生物素标记探针来富集和检测特定的DNA片段。当目标序列存在于样本基因组中时，会与探针发生特异性杂交结合。通过将提取的基因组DNA片段化后与探针杂交，利用链霉亲和素磁珠可以特异性地富集含有目标序列的DNA片段。液相杂交捕获技术已应用于CASGEVY等多个基因编辑治疗产品的脱靶安全性评估，是业界广泛采用的全基因组脱靶检测方法，为基因编辑产品的质量控制提供可靠的技术支撑。

TES检测流程主要包括以下几个环节：首先对待检测DNA样本进行文库构建，通过超声将基因组DNA随机打断至150-300bp片段，在末端修复和加A反应后连接含有UMI序列的特异性接头，使每个DNA分子获得唯一的分子标签；随后根据目标序列信息设计合成特异性探针，将UMI标记的文库与探针进行液相杂交并使用链霉亲和素磁珠进行双重捕获，富集含有目标序列的DNA片段；最后通过PCR扩增增强目标信号并构建测序文库，在数据分析阶段利用UMI序列进行分子水平去重，实现对目标序列的精确定量。相比于传统方法，UMI技术的液相杂交捕获方法不仅能够更全面地捕获目标序列，还通过分子标签技术消除了PCR扩增偏向性，显著提高了检测的准确性、灵敏度和定量精度。

图2 液相杂交捕获测序原理图

3. 液相杂交捕获脱靶位点检测与分析优势

3.1 多位点同步验证的高效平台

（1）多位点并行分析：单次实验可同时捕获和分析数百至上千个潜在脱靶位点，大幅提高检测通量，相比扩增子方法每个位点需单独设计引物和建库的流程，效率提升10-100倍；

（2）标准化工作流程：所有位点在完全相同的实验条件下进行捕获和测序，消除了多次建库和测序可能带来的批次效应，提高了数据的可比性；

（3）资源利用优化：通过一次性捕获多个位点，显著降低了试剂消耗和人工成本，同时减少了测序资源的浪费，特别适合大规模脱靶安全性评估初筛；仅需一次DNA提取和文库制备，大大降低了样本消耗，尤其适合珍贵样本的分析。

3.2 卓越的数据质量与准确性

（1）UMI技术降低假阳性：在测序接头中整合了独特分子标识符(UMI)技术，每个原始DNA分子被赋予唯一的分子标签，通过生物信息学分析可有效识别并消除PCR扩增和测序过程中产生的错误，将假阳性率从传统方法的~1%降低至0.01%以下，确保数据真实可靠；

（2）高灵敏度检测：得益于UMI技术和优化的实验流程，液相杂交捕获可靠检测限达0.2%，能在500个正常细胞中准确识别单个携带脱靶编辑的细胞，为低频率脱靶事件检测提供强有力的技术支持

3.3 服务优势

（1）技术平台领先：可全面检测基因编辑引起的多种脱靶突变类型，包括替换、插入、缺失等，满足生物研发各阶段安全性评估需求；

（2）提供科学严谨的脱靶位点过滤策略；

（3）全面的肿瘤相关基因注释：对每个高频(≥0.2%)脱靶位点进行详细的肿瘤基因注释，整合ONCOGENE数据库信息，标注与癌症相关的激活基因；结合TSG(tumor suppressor genes)数据，识别肿瘤抑制基因，提供完整的基因功能描述和潜在风险评估。

（4）成功案例丰富：已成功为多家国内治疗企业提供服务，协助产品顺利完成IND申报。

4. 案例展示

舒桐科技提供的液相杂交捕获脱靶验证分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与实验原理介绍、技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）提供科学严谨的脱靶位点过滤策略，展示各个条件过滤的位点数以及最终保留的脱靶位点数。

（2）提供所有高频(≥0.2%)脱靶位点的位置信息以及原始突变率和经过数据背景的过滤突变率，便于评估真实的脱靶编辑水平。

图3 每个样本高频（≥0.2%）脱靶位点的具体信息展示（示例）

（3）不仅仅关注脱靶位点的频率，还深入分析其潜在的生物学意义，特别是与肿瘤发生发展的相关性。通过区分普通基因、肿瘤抑制基因(TSG)和癌基因(oncogene)，帮助对脱靶位点进行风险分级，优先关注高风险位点。

图4 每个样本高频（≥0.2%）脱靶位点基因注释（示例）

（4）提供高频脱靶位点可视化分析：参考序列与编辑序列的精确比对；sgRNA结合位点与潜在切割位点的清晰标注；编辑类型的直观反映。同时，可视化结果同步展示实验组与对照组的reads数及突变频率，通过以实验组编辑效率减去对照组背景编辑效率的方式过滤背景噪音，经背景过滤后编辑效率≥0.2%的位点被判定为高频脱靶位点。这种分子水平的精确分析让决策者能够直观理解编辑位点的具体变化，并区分真实的基因编辑信号与测序背景噪音。

图5 高频脱靶位点（≥0.2%）变异结果可视化（示例）

6. 服务内容

*服务周期：标准流程20-30个工作日；

7. 样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送组织或细胞渣样本用于DNA提取，组织要求重量>50mg，细胞渣要求>1×10^5/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

8. 参考文献

[1] 国际人用药品注册技术协调会. (2005). ICH三方协调指导原则：分析方法论证：正文和方法学 Q2(R1) [现行第4阶段版本].

[2] 美国食品药品监督管理局. (2018年5月). 生物分析方法验证：行业指南. 美国卫生与公共服务部食品药品监督管理局药品评价和研究中心与兽医药品中心.

[3] FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》2024