扩增子脱靶位点验证
扩增子脱靶位点验证
1. 背景介绍
根据最新发布的FDA基因治疗产品指南文件（2024年1月），对于人类基因组编辑的基因治疗产品安全性评估，监管机构明确提出了全面的要求。该指南特别强调了对脱靶编辑事件的识别和验证的重要性，包括类型、频率和位置的全面分析。监管要求指出："验证脱靶位点应采用具有足够灵敏度的方法来检测低频率事件"，并且脱靶位点来源应使用多种方法（如生物信息学预测、生化分析、细胞基础分析等）进行基因组范围的分析，以减少潜在脱靶位点识别中的偏差。
图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》安全性评估关于脱靶验证的指导
在这一监管背景下，扩增子脱靶验证作为一种高灵敏度的脱靶检测方法应运而生。通过特异性引物设计和高通量测序技术，能够实现对低频率脱靶事件（≥0.1%）的精确检测和定量。扩增子方法具有灵敏度高、可定量等优点，特别适合对多样本、多位点进行深度分析，有效满足了监管机构对脱靶事件精确验证的要求。为确保技术的可靠性与准确性，舒桐科技团队依照ICH Q2(R1)指导原则及FDA《生物分析方法验证：行业指南》，开展了系统的方法学验证，建立了完整的技术评估体系。舒桐科技目前已成功为多家国内外基因治疗企业提供符合监管标准的基因编辑安全性评估服务，全方位支持IND申报及临床转化。
2. 扩增子检测原理
扩增子脱靶检测围绕脱靶位点区域展开研究。先从样本中提取基因组DNA，设计靶点特异性引物。经第一轮 PCR特异性扩增后，磁珠纯化去除杂质。再用带index的引物进行第二轮PCR，为样本添加标签。随后通过二代测序获取目标区域序列信息，最后经生物信息学分析识别序列特征与量化脱靶编辑效率。详细的检测步骤包括：
（1）依据潜在脱靶区域特定序列信息，设计与之特异性结合的靶点引物。
（2）以提取的基因组DNA为模板，借助设计好的靶点特异性引物，经PCR特异性扩增目标基因位点区域。
（3）利用磁珠在特定缓冲液中与 DNA 结合的特性，吸附PCR产物中的DNA，去除引物二聚体等杂质，纯化PCR产物。
（4）第二轮index PCR是在纯化的PCR产物中加入带特定标签（index）的引物进行扩增。
（5）采用二代测序技术，对两轮PCR扩增后的目标基因区域高通量测序，快速获取大量DNA序列信息。
（6）最后，生物信息学分析是将二代测序得到的海量数据进行处理和解读。
图2 扩增子脱靶验证建库流程图
3. 扩增子脱靶位点验证与分析优势
3.1 全面精准检测脱靶编辑事件
（1）精确定量分析：CRISPResso2分析工具能够精确定量不同类型的编辑事件（替换、插入、缺失等），提供全面的脱靶特征分析。
（2）低频脱靶检测：能够检测频率低至0.01%的罕见脱靶事件，大幅提升基因编辑安全性评估的灵敏度；
（3）可视化展示直观：报告中提供了编辑事件的可视化展示，直观呈现编辑位点和编辑类型，有助于研究人员深入理解脱靶特征。
3.2 卓越的检测性能
舒桐科技依据ICH Q2(R1)指导原则，对扩增子脱靶验证方法进行了系统性方法学验证，验证结果如下：
验证参数 | 验证结果 |
准确性 | 在50%~0.001%浓度梯度下，阳性标准品检出率达100% |
精密度 | 在 0.01~50%浓度梯度下，扩增子三次重复实验的变异系数均在合理阈值下，说明该方法具有较好的重复性 |
灵敏度 | 0.001%~50%浓度范围内检测结果与理论值线性相关性R²>0.99 (P<0.05) |
灵敏度 | 能准确检测浓度低至0.01%的阳性标准品，且呈现良好的重复性和线性趋势，因此 0.01%是该方法的最低定量限（LLOQ） |
3.3 服务优势
（1）方法学验证完善：扩增子脱靶验证已通过系统性验证，具备0.001%-50%全线性范围的高灵敏度和精准性；
（2）监管合规保障：严格遵循ICH Q2(R1)及FDA指南要求，确保检测结果符合国际监管标准；
（3）技术平台领先：可全面检测基因编辑引起的多种脱靶突变类型，包括替换、插入、缺失等，满足生物研发各阶段安全性评估需求；
（4）成功案例丰富：已成功为多家国内治疗企业提供服务，协助产品顺利完成IND申报。
（5）快速出报告：标准化的数据处理流程实现从测序数据到分析报告的快速转化，缩短项目周期。
4. 扩增子脱靶验证应用场景
（1）基因治疗IND申报：为基因编辑产品开发提供符合监管要求的脱靶安全性评估数据；
（2）基因编辑工具优化：量化不同设计sgRNA的脱靶效应，指导更安全的基因编辑工具开发；
（3）细胞制品质量控制：为CAR-T等基于基因编辑的细胞疗法提供脱靶检测，确保产品安全性。
5. 案例展示
舒桐科技提供的扩增子脱靶验证分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与实验原理介绍、技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息（包括样本ID、实验/对照组分类、sgRNA序列及核酸酶）、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：
（1）提供全面的基因组编辑效率分析表格，展示关键指标包括：比对读数总量，确保分析的统计学可靠性；编辑读数计数，精确量化编辑事件发生频次；编辑效率百分比，直观展现编辑效率。这种高精度量化分析能力清晰了解基因编辑工具的实际脱靶效应，为产品安全性提供可靠依据。
图3 基因编辑效率统计表
（2）提供多维度的编辑事件分析表格，包括：单一事件分析：替换(Sub)、插入(Ins)、缺失(Del)的独立发生率；复合事件统计：Ins+Del、Ins+Sub、Del+Sub等复合编辑事件的比例；InDel综合分析，这种精细的分型分析为基因编辑工具特性提供深度洞察。
图4 基因编辑分类统计表
（3）提供单碱基分辨可视化分析：参考序列与编辑序列的精确比对；sgRNA结合位点与切割位点的清晰标注；编辑类型的直观反映，这种分子水平的精确分析让决策者能够直观理解编辑位点的具体变化。
图5 编辑产物可视化图
6. 服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询与评估 | 评估靶点特性，制定个性化检测方案，进行项目报价 |
样本接收与质检 | 严格按标准对样本进行全面质检，确保符合建库要求 |
引物设计 | 在切割位点上下游200bp区域设计高特异性引物 |
专业建库 | 执行标准化建库流程 |
高通量测序 | 文库质检合格后进行PE150测序，确保数据质量 |
生物信息学分析 | 基因编辑效率统计、编辑分类统计、过滤分析、可视化等 |
专业报告交付 | 提供标准化分析报告，含技术解读与咨询服务 |
IND申报支持 | 可按客户需求提供符合ICH Q2(R1)和FDA要求的方法学验证报告 |
*服务周期：标准流程20-30个工作日；
7. 样本要求
| 类别 | 具体要求 |
| DNA样本标准 | ·总量：待检测的DNA样本Qubit定量大于等于100ng/位点；总DNA量等于100ng*脱靶位点数目； ·浓度：大于等于20ng/μL； ·纯度：OD260/280=1.8~2.0； ·完整性：无降解（需提供凝胶电泳检测图） |
| 实验分组要求 | ·建议同时提供实验组和对照组样本（申报必须） |
| 客户需同时提供样本信息 | ·样本类型及名称； ·脱靶位点序列； ·核酸酶类型 |
*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送组织或细胞渣样本用于DNA提取，组织要求重量>50mg，细胞渣要求>1×10^5/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] 国际人用药品注册技术协调会. (2005). ICH三方协调指导原则：分析方法论证：正文和方法学 Q2(R1) [现行第4阶段版本].
[2] 美国食品药品监督管理局. (2018年5月). 生物分析方法验证：行业指南. 美国卫生与公共服务部食品药品监督管理局药品评价和研究中心与兽医药品中心.
[3] FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》2024
[4] Bennett, E. P., Petersen, B. L., Johansen, I. E., Niu, Y., Yang, Z., Chamberlain, C. A., Met, Ö., Wandall, H. H., & Frödin, M. (2020). INDEL detection, the 'Achilles heel' of precise genome editing: a survey of methods for accurate profiling of gene editing induced indels. Nucleic Acids Research, 48(21), 11958-11981.