PE-tag先导编辑脱靶检测

PE-Tag先导编辑脱靶检测

1. 背景介绍

随着CRISPR等基因编辑技术在基因治疗领域的广泛应用，其安全性评估变得尤为重要。美国食品药品监督管理局（FDA）已明确要求对基因编辑产生的潜在脱靶效应进行全面评估。Prime Editor（PE）作为一种不依赖于双链断裂（DSB）的精准基因编辑技术，具有高精度和高特异性的特点，但其潜在的脱靶效应仍需系统性评估。

舒桐科技推出的Primer-Extension-Mediated tagging sequencing（PE-Tag）基因编辑脱靶检测平台，基于NGS技术实现对Prime Editor编辑活动的全基因组范围内精准捕获和分析。该技术通过在编辑位点引入特定标签序列，结合高通量测序技术，可全面检测PE系统在全基因组范围内的编辑活动，为科学研究和临床前安全性评估提供关键技术支持。客户可根据不同研究需求，灵活选择检测策略：体外纯化DNA的in vitro PE-Tag检测以实现高灵敏度全面筛查，以及模拟真实生物环境的in cells PE-Tag检测，确保脱靶分析结果的生物学相关性。

2. PE-Tag检测原理与灵活检测策略

PE-Tag技术是一种高灵敏度的全基因组范围内Prime Editor编辑活动检测方法，其原理是利用Prime Editor在编辑位点引入标签序列，然后通过特异性扩增和高通量测序实现全基因组编辑位点的检测。舒桐提供In vitro PE-Tag和In cells PE-Tag两种检测策略以满足不同研究需求：

2.1 In vitro PE-Tag（纯DNA层面检测）

（1）原理：利用纯化的PE2蛋白与含有标签序列的pegRNA在体外处理提取的基因组DNA，随后通过特异性扩增和高通量测序实现编辑位点的检测；

（2）优势：敏感性高、背景低、可检测更多低频脱靶位点，无需考虑细胞转染效率限制；

（3）适用场景：对脱靶检测灵敏度要求高的项目，初步筛选潜在脱靶位点，或不便于细胞转染的样本。

图1 In vitro PE-Tag建库原理

2.2 In cells PE-Tag（细胞层面检测）

（1）原理：通过细胞转染或电转将PE2蛋白和pegRNA导入活细胞中，使编辑在细胞内发生，更接近真实生物条件；

（2）优势：可反映细胞环境中的真实编辑情况，考虑了细胞屏障、染色质状态等因素的影响；

（3）适用场景：验证高置信度脱靶位点，模拟临床应用场景，评估在复杂生物环境中的编辑特异性。

图2 In cells PE-Tag建库原理

2.3 PE-Tag建库流程

PE-Tag建库流程主要包括：

（1）编辑体系引入：将PE2系统（蛋白、mRNA或质粒形式）与含有目标序列和标签的pegRNA导入反应体系（体外）或细胞（体内）；

（2）标签整合：在活性位点（包括靶位点和脱靶位点）引入特定标签序列；

（3）片段化：使用Tn5转座酶对标记后的基因组DNA进行片段化，同时引入包含唯一分子标识符（UMI）的接头序列；

（4）通过PCR特异性扩增含有标签序列的DNA片段；

（5）使用高通量测序技术对扩增产物进行测序；

（6）通过专业生物信息学分析流程精确鉴定全基因组范围内的PE编辑位点。

3. PE-Tag与分析优势

3.1 全面捕获Prime Editor编辑活动

PE-Tag技术能够高效检测以下几类Prime Editor编辑事件：

（1）靶点编辑：精确检测目标位点的编辑效率和编辑模式；

（2）脱靶编辑：全面捕获全基因组范围内潜在的脱靶位点；

（3）pegRNA设计评估：评估不同pegRNA设计的特异性和脱靶风险。

3.2 技术特点与优势

（1）高特异性：特异性捕获Prime Editor活动位点，降低假阳性率；

（2）全基因组覆盖：不依赖于预测算法，真实反映编辑系统在全基因组范围内的活性；

（3）检测策略灵活：可根据项目需求选择in vitro或in cells检测模式，兼顾灵敏度与生物相关性；

（4）多样本类型适用：可用于体外纯化DNA、细胞株和体内样本分析；

（5）直接检测：基于真实的Prime Editor活动进行检测，而非间接推测；

（6）与多种PE系统兼容：适用于PE2、PEmax、epegRNA等多种Prime Editor系统的评估。

3.3 服务优势

（1）定制化检测方案：根据研究目的、样本类型和编辑系统，提供最适合的PE-Tag检测策略（in vitro或in cells）；

（2）全面评估：提供包括靶位点和脱靶位点在内的完整PE编辑谱分析；

（3）多层次分析：从分子水平全面评估基因编辑的脱靶效应；

（4）灵活应用：适用于科研探索和临床前安全性评估；

（5）专业报告：提供包含编辑效率、脱靶位点分析和功能注释的专业分析报告；

（6）数据解读：提供专业的数据解读和技术咨询，辅助实验设计和结果分析。

4. 技术应用场景

4.1 应用领域

（1）基础科研应用：支持学术研究中Prime Editor系统的优化与改进；

（2）pegRNA设计优化：筛选特异性最高、脱靶风险最低的pegRNA序列；

（3）临床前安全性评价：为基因编辑药物的安全性评估提供数据支持；

（4）编辑系统比较：评估不同Prime Editor系统（如PE2、PEmax、epegRNA等）的编辑特异性；

（5）靶点安全性评估：评估不同治疗靶点的潜在脱靶风险；

（6）药物研发支持：为基因治疗药物开发提供关键的安全性数据。

5. PE-Tag检测报告内容

舒桐科技提供的PE-Tag分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与技术原理介绍、PE-Tag建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本测序数据统计部分，详细整理了样本数据质控信息与比对结果，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）脱靶位点鉴定结果：系统展示通过PE-Tag鉴定到的潜在脱靶位点，包括脱靶位点位置信息、位点序列、与靶序列的匹配度以及UMI计数等关键数据。

图3 PE-Tag示例报告（脱靶位点鉴定）

（2）脱靶序列比对可视化：通过直观的序列比对图谱，展示脱靶位点与pegRNA序列的相似性与差异，标注关键的错配位点，帮助客户直观理解脱靶位点的序列特征与原因。

图4 PE-Tag示例报告（脱靶序列比对可视化）

（3）脱靶位点基因注释：对鉴定到的脱靶位点进行功能注释分析，包括最近基因、位置特征（外显子、启动子区等）以及是否涉及致癌基因等关键信息，评估脱靶事件的潜在生物学影响。

图5 PE-Tag示例报告（脱靶位点基因注释）

6. PE-Tag检测服务内容

*服务周期：标准流程20-30个工作日；

*服务特色：可提供从pegRNA设计到结果分析的一体化服务支持，根据研究需求灵活选择in vitro或in cells检测策略。

7. PE-Tag检测样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送组织或细胞渣样本用于DNA提取，组织要求重量>50mg，细胞渣要求>2×10^5；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

8. 参考文献

[1] Liang, S. Q., Liu, P., et al. (2023). Genome-wide profiling of prime editor off-target sites in vitro and in vivo using PE-tag. Nature Methods, 20(5), 738-748.

[2] Anzalone, A. V., et al. (2019). Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature, 576(7785), 149-157.

[3] Chen, P. J., et al. (2021). Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell, 184(22), 5635-5652.

[4] Nelson, J. W., et al. (2021). Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nature Biotechnology, 40(3), 402-410.

[5] Liu, P., et al. (2021). Improved prime editors enable pathogenic allele correction and cancer modelling in adult mice. Nature Communications, 12(1), 2121.

[6] Gao, R., et al. (2022). Genomic and transcriptomic analyses of prime editing guide RNA-independent off-target effects by prime editors. CRISPR Journal, 5(2), 276-293.