Detect-seq CBE碱基编辑脱靶检测

Detect-seq CBE碱基编辑脱靶检测

1. 背景介绍

随着基因编辑技术的迅猛发展，碱基编辑（Base Editing）作为一种新型精准基因编辑工具正逐渐崭露头角。与传统的双链断裂（DSB）形式的编辑技术（如CRISPR-Cas9）相比，CBE（胞嘧啶碱基编辑）系统提供了更加精准的单碱基修改能力，无需依赖双链断裂修复过程，从而降低了大型基因组结构失稳的风险。当前，CBE技术在多种单基因遗传病的治疗上展现出巨大前景，特别是对于涉及点突变的疾病，如镰状细胞贫血、β-地中海贫血、遗传性耳聋、高胆固醇血症等。CBE的精准性使其成为这些疾病潜在的理想治疗手段。

随着CBE技术向临床转化的进程加速，FDA及CDE在相关指南中明确要求基因编辑产品进行全面的脱靶风险评估，并强调采用多种方法识别潜在的脱靶位点。在此背景下，detect-seq作为专门针对CBE系统设计的脱靶检测方法应运而生，为CBE编辑技术的临床转化和IND申报提供了关键的安全性评估工具。

舒桐科技推出Detect-seq (dU-detection enabled by C-to-T transition during sequencing) 碱基编辑脱靶检测平台，基于NGS技术实现对CBE系统诱导的C-to-T碱基转换精准检测。为确保技术的可靠性与准确性，舒桐科技团队依照ICH Q2(R1)指导原则及FDA《生物分析方法验证：行业指南》，开展了系统的方法学验证，建立了完整的技术评估体系。舒桐科技目前已成功为多家国内外基因治疗企业提供符合监管标准的基因编辑安全性评估服务，全方位支持IND申报及临床转化。

2. 项目原理

Detect-seq是一种专为CBE（胞嘧啶碱基编辑器）开发的体外脱靶检测技术，它巧妙地利用了CBE编辑过程中产生的中间产物脱氧尿嘧啶(dU)来识别编辑位点。其工作原理是先从碱基编辑后的细胞中提取基因组DNA，然后通过生物素标记CBE产生的dU，用于富集含有编辑位点的DNA片段。同时，在dU位点下游，将正常的胞嘧啶 (C) 替换为5-醛基胞嘧啶 (d5fC)，随后d5fC被丙二腈化学标记为胸腺嘧啶 (T)。这一过程使得在测序时能够观察到明显的串联C-to-T突变信号，从而准确定位基因组中所有的碱基编辑位点，实现对CBE在全基因组范围内脱靶效应的全面评估。

图1 Detect-seq的检测原理

3. 项目优势

3.1 全面精准检测多种类型的脱靶事件

Detect-seq技术可高效检测以下几类单碱基编辑产生的脱靶事件：

（1）sgRNA依赖性脱靶: 精确识别Cas9 RNP复合物错误识别结合到相似序列位点产生的编辑作用；

（2）sgRNA非依赖性脱靶: 检测由BE的胞苷脱氨酶组分对DNA底物进行随机编辑造成的基因组范围内脱靶突变；

（3）新型脱靶类型识别: 能够检测两种新型sgRNA依赖性脱靶：sgRNA结合区外脱靶（out-of-protospacer edits）和靶向链编辑脱靶（target-strand edits）。

3.2 卓越的检测性能

基于严格的验证标准和国际认可的评估方法，从四个关键维度对Detect-seq技术进行了全面系统验证：

3.3 服务优势

（1）方法学验证完善: Detect-seq已通过系统性验证，具备0.1%-50%全线性范围的高灵敏度和特异性；

（2）监管合规保障: 严格遵循ICH Q2(R1)及FDA指南要求，确保检测结果符合国际监管标准；

（3）技术平台领先: Detect-seq能全面检测单碱基编辑产生的各类脱靶事件，包括sgRNA依赖性脱靶、sgRNA非依赖性脱靶、sgRNA结合区外编辑和靶向链编辑等，满足药物研发各阶段安全性评估需求；

（4）成功案例丰富: 已成功为多家基因治疗企业提供服务，协助产品顺利完成IND申报；

（5）全流程服务模式: 从靶点安全性预评估、样本检测到IND申报数据支持，提供全流程单碱基编辑安全性解决方案。

4. 应用场景

（1）基因治疗安全性评估：在临床前研究阶段全面评估基因编辑工具的脱靶效应；

（2）新型碱基编辑器开发：为开发更高特异性的碱基编辑器提供评估手段；

（3）sgRNA设计优化：辅助设计具有更高特异性的sgRNA；

（4） 不同细胞类型的脱靶分析：研究不同细胞背景下的脱靶模式差异；

（5）学术研究：探索基因编辑机制和脱靶效应的分子基础。

5. Detect-seq检测报告示例

舒桐科技提供的Detect-seq分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与实验原理介绍、Detect-seq技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息(样本名称、编辑工具、靶点信息等）、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）sgRNA的在靶和脱靶位点可视化：通过泊松分布检验，分析确定了sgRNA在基因组中可能的结合位点及其编辑情况。表格第一行为目标靶位点，无错配；下方行展示了多个潜在脱靶位点，错配数从2.0至11.0不等，分布在不同染色体和正负链上，帮助直观地呈现了基因编辑系统的靶向特异性和潜在脱靶风险，为评估编辑精确性和实验安全性提供了重要依据。

图2 在靶和脱靶位点可视化图

（2）在靶/脱靶位点碱基分布：展示了在靶位点和脱靶位点碱基频率分布seqlogo图，用于评估sgRNA结合区域的保守性。通过信息熵(bits)直观呈现了每个位点上碱基的出现频率和保守程度，其中高度越高的碱基表示在该位点的保守性越强。这一分析帮助客户理解sgRNA与基因组结合的序列特征及位点特异性，为评估编辑系统的精确度和潜在脱靶效应提供了分子水平的证据。

图3 在靶和脱靶位点碱基频率分布的 seqlogo 图

（3）提供在靶和脱靶位点碱基编辑情况：展示了各位点上不同碱基的分布频率及编辑模式，能够帮助评估基因编辑系统的特异性、识别实际脱靶事件、比较不同位点的编辑效率差异，从而全面了解编辑工具的安全性和精确性。通过这种综合分析，能够获得基因编辑实验的可靠证据，为优化系统设计、降低脱靶风险和确保实验应用的安全有效性提供重要依据。

图4 各位点上不同碱基的分布频率及编辑模式

6. 服务内容

*服务周期：标准流程20-30个工作日；

*服务特色：可提供从sgRNA设计到结果分析的一体化服务支持。

7. 样本要求

8. 参考文献

[1] Anzalone AV, Koblan LW, Liu DR. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 2020;38(7):824-844. doi:10.1038/s41587-020-0561-9

[2] Rees HA, Liu DR. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells [published correction appears in Nat Rev Genet. 2018 Oct 19;:]. Nat Rev Genet. 2018;19(12):770-788. doi:10.1038/s41576-018-0059-1

[3] Lei Z, Meng H, Lv Z, et al. Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors. Nat Methods. 2021;18(6):643-651. doi:10.1038/s41592-021-01172-w

[4] Lei Z, Meng H, Rao X, Zhao H, Yi C. Detect-seq, a chemical labeling and biotin pull-down approach for the unbiased and genome-wide off-target evaluation of programmable cytosine base editors. Nat Protoc. 2023;18(7):2221-2255. doi:10.1038/s41596-023-00837-4