AID-seq体外脱靶检测

AID-seq体外脱靶检测

1. 背景介绍

从科学基础研究到临床应用，基因编辑技术正以前所未有的速度重新定义医学边界，而这一革命性进程中，脱靶效应评估已成为科研突破与临床转化的关键节点。学术界需要精准脱靶数据揭示编辑机制并指导开发下一代高保真工具；药企研发人员依赖全面脱靶分析为候选产品把关，决定其能否跨越临床门槛；监管机构则将脱靶评估视为确保患者安全的不可逾越屏障。这多维度需求正推动着高灵敏度、无偏见脱靶检测方法的快速发展。

FDA在《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》(2024)中明确要求基因编辑产品进行全面的脱靶风险评估，强调应采用多种方法进行基因组范围的分析以减少潜在脱靶位点识别中的偏差。其中FDA特别指出的"biochemical"（生化水平检测）正是基于体外DNA切割的实验方法，这类方法能在不受细胞环境限制和因素影响下全面检测编辑工具的脱靶位点。CDE在《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》(2022)中也和FDA一致要求对脱靶事件进行多维度的方法识别。

图1 FDA/CDE针对脱靶检测的指南要求

舒桐经过多年不懈努力，开发了一种新型的高通量的体外脱靶检测方法AID-seq，与现有的脱靶检测方法相比，其敏感性和特异性均更胜一筹。更重要的是，AID-seq提出了高通量sgRNA筛选策略，可一次性检测上百条sgRNA的在靶/脱靶情况，并基于大量的数据建立新型CRISPR蛋白的脱靶预测模型。为确保技术的可靠性与准确性，舒桐科技团队依照ICH Q2(R1)指导原则及FDA《生物分析方法验证：行业指南》，开展了系统的方法学验证，建立了完整的技术评估体系。舒桐科技目前已成功为多家国内外基因治疗企业提供符合监管标准的基因编辑安全性评估服务，全方位支持IND申报及临床转化。

2. 项目原理

AID-seq是一种高效的全基因组脱靶检测方法，其基本原理是基因组DNA被随机打断并与发夹结构的i7接头连接，形成“哑铃状”结构。然后，使用三种不同的核酸外切酶混合物将游离的DNA消化，该步骤可重复2-4次，以最大程度去除背景DSB产生的假阳性。剩余的双端成功连接上接头的“哑铃状”DNA与Cas9或Cas12a核糖核蛋白 (RNP) 复合物进一步孵育，暴露新切割的DNA末端，然后与生物素修饰的i5接头连接。这些生物素接头连接的DNA将通过链霉亲和素磁珠富集。最后，通过巢式PCR构建上机文库。

图2 AID-seq脱靶检测原理图

3. AID-seq脱靶检测与分析优势

3.1 全面捕获基因组编辑产生的DSB位点

（1）体外切割：使用纯化的组分试剂进行体外实验，提高了检测的可重复性，避免了细胞转染效率及细胞修复对检测的影响。另外，体外实验中可大幅度提高sgRNA及Cas酶的浓度，有利于检测出低频突变位点；

（2）全基因组无偏倚脱靶检测：不依赖于生物信息学预测，通过核酸外切酶混合物处理消除背景DNA，能够发现新的、未预期的脱靶位点；

（3）低频脱靶事件捕获：灵敏度高，通过多轮酶切处理和生物素富集，可检测低频率的脱靶事件，为sgRNA安全性评估提供可靠数据。

（4）Pooled AID-seq高通量筛选：作为快速筛选最佳sgRNA的强大工具，可同时评估多个sgRNA的脱靶特性，大幅提高筛选效率，为CRISPR应用提供最优指导。

3.2 卓越的检测性能

3.2.1 方法学验证

舒桐科技严格遵循国际实验标准，从四个关键维度对AID-seq技术进行全面系统验证：

3.2.2 和其他同类方法比较:具有更高的敏感性和特异性

        通过对VEGFA site1、EMX1、FANCF等核心靶点的检测分析发现：AID-seq对GUIDE-seq验证的真实脱靶位点检出率在各靶点均居首（图3B），多个靶点实现100%检出，显著高于其他方法；PR曲线（图3C）和ROC曲线（图3D）显示，AID-seq的AUPRC和AUROC值均为最高，表现均显著优于其他三种方法，说明AID-seq在高效检出真实脱靶位点的同时能最大程度降低假阳性，展现出远超现有方法的脱靶检测灵敏度与特异性，且该优异性能在不同靶点中保持稳定。

图3 AID-seq、SITE-seq、CIRCLE-seq、CHANGE-seq 与 GUIDE-seq 的脱靶检测灵敏度和特异性对比

3.3 服务优势

（1）方法学验证完善：AID-seq已通过系统性验证，检测流程严格遵循ICH Q2(R1)及FDA生物分析方法验证指南，确保检测结果符合国内外监管标准；

（2）技术平台领先：通过创新的"哑铃状"DNA结构与核酸外切酶混合物处理，能够高效去除背景DSB产生的假阳性，确保检测结果的准确性和可靠性；

（3）脱靶位点全面注释：提供脱靶位点的染色体定位、基因区域、与癌基因的关系等多维度注释信息，全面评估脱靶风险；

（4）成功案例丰富：已成功为多家基因治疗企业提供AID-seq脱靶检测服务，协助产品顺利完成IND申报；

（5）定制化分析方案：根据靶点特性和编辑系统（Cas9/Cas12等）提供定制方案；

（6）全流程服务模式：从基因编辑设计评估、样本检测到IND申报数据支持，提供全链条安全性评价解决方案。

4. 应用场景

（1）靶点筛选阶段脱靶风险评估：通过全基因组范围内脱靶位点的定性鉴定，帮助研发团队筛选脱靶风险最低的靶点；

（2）基础研究工具：作为研究CRISPR-Cas系统特异性机制的重要工具，推动基因编辑技术的改进和优化；

（3）临床前安全性评价：满足监管机构对基因编辑药物脱靶检测的严格要求，为转化研究提供关键安全性数据；

（4） IND申报数据支持：提供符合CDE和FDA要求的细胞水平维度的脱靶检测报告，支持基因编辑药物的临床申报；

除此之外，Pooled AID-seq还有如下应用场景：

（1）通过pooled AID-seq策略可以筛选出切割效率最高、脱靶效应最低的sgRNA进行基因编辑和治疗；

（2）用于CRISPR文库优化：CRISPR文库常用于识别药物敏感性和耐药性的基因，然而，文库可能包含性能不佳的sgRNA，增加了不必要的文库大小并导致强烈的混杂效应。因此，有必要使用pooled AID-seq策略针对全基因组或一类特殊目标筛选最佳sgRNA减少文库大小和提高文库性能；

（3）AID-seq可用作通用工具，以大规模并行方式表征新发现的CRISPR的特性，如切割效率、脱靶效应和PAM偏好，并基于这些大量的数据构建脱靶预测模型。

5. 案例分析

舒桐科技提供的AID-seq分析报告采用标准化格式，确保数据呈现的专业性与完整性。报告前部分包含项目背景与实验原理介绍、AID-seq技术原理、建库流程说明以及生物信息学分析流程概述，为客户提供必要的技术背景。随后是样本信息与测序数据统计部分，详细记录样本基本信息、原始测序数据质控指标以及比对参考基因组的结果统计，确保数据质量可靠性。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）AID-seq检测到的在靶具体信息：

图4 AID-seq示例报告（在靶详细信息）

（2）AID-seq 检测到的脱靶位点基本信息及基因注释：报告可提供基因编辑实验中的脱靶分析详细信息，包括样本名称、染色体编号、脱靶位点起始坐标、影响的基因及其距离信息、基因组位置类型(如基因间区、内含子区)以及是否涉及癌基因等关键数据

图5 AID-seq示例报告（脱靶详细信息）

（3）脱靶位点可视化：报告提供每个样本基因编辑系统的靶序列匹配情况和脱靶分析。图中顶部显示了参考sgRNA序列，下方则是各个潜在脱靶位点与该靶序列的比对结果。每行代表一个脱靶位点，彩色标记显示匹配的碱基，点(.)表示与靶序列相同的碱基，字母表示错配碱基。图表还包含每个位点的测序读数。可视化能够直观展示基因编辑工具的靶向精确性和脱靶模式，同时评估在靶效能和潜在的脱靶风险。

图6 AID-seq示例报告（脱靶位点可视化）

6. 服务内容

*服务周期：标准流程20-30个工作日；

*服务特色：可提供从sgRNA设计到结果分析的一体化服务支持。

7. 样本要求

8. 参考文献

[1] Tian, R. et al. Massively parallel CRISPR off-target detection enables rapid off-target prediction model building. Med, doi:10.1016/j.medj.2023.05.005 (2023).

[2] Cui, Z. et al. FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity. Nat Commun 13, 1425, doi:10.1038/s41467-022-29089-8 (2022).