单细胞BCR免疫组库测序

单细胞BCR免疫组库测序

1. 背景介绍

B细胞受体（B Cell Receptor，BCR）多样性是体液免疫应答的分子基础，其克隆组成与亚型分布、亲和力成熟状态与肿瘤免疫、自身免疫性疾病、感染性疾病及抗体药物研究密切相关。抗体由重链（IgH）与轻链（IgK/IgL）配对组成，传统Bulk BCR测序可分别描述重链或轻链的克隆组库，但无法确定同一B细胞的重链与轻链天然配对关系，亦无法将克隆型与单细胞表型直接关联，限制了对B细胞功能异质性及抗体发现的深入解析。

单细胞BCR测序（single-cell BCR sequencing）基于液滴或微孔单细胞平台，在单细胞分辨率下为每个B细胞加载唯一的细胞条形码（cell barcode）与UMI，实现BCR重链（IgH V-D-J重组）与轻链（IgK/IgL V-J重组）全长V(D)J序列的天然配对捕获，并同步解析抗体亚型（IgM/IgG/IgA/IgD/IgE）与体细胞超突变（Somatic Hypermutation，SHM）信息。结合同一平台的单细胞转录组测序（scRNA-seq），可将克隆型信息与细胞表型、功能状态及分化轨迹直接关联，为B细胞免疫研究提供前所未有的分辨率。

在前沿抗体药物研发与细胞治疗领域，单细胞BCR测序的价值已获广泛认可。FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）及中国CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022年第30号）对细胞治疗产品的克隆构成与受体链配对表征提出明确要求；FDA《Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products》（2020）亦关注克隆性扩增等迟发风险的精细化监测。配对的天然VH-VL序列可直接作为治疗性抗体发现的起始序列，是抗体药物研发的重要工具。

舒桐科技提供从样本质检、单细胞捕获建库、高通量测序到系统生物信息分析的全流程服务，助力客户在单细胞分辨率下精准解析B细胞克隆动态、亚型分化与抗体序列信息。

2. 技术原理

单细胞BCR测序基于5' V(D)J捕获方案，通过液滴微流控或微孔单细胞平台，在单细胞水平实现BCR全长V(D)J序列的高效扩增与天然配对测序。技术流程分为以下核心步骤：

（1）单细胞悬液制备与捕获

制备高活性单分散细胞悬液后，通过液滴或微孔平台捕获单个B细胞。为每个细胞加载唯一的细胞条形码与UMI，确保后续数据去重与单细胞精准溯源。

（2）逆转录与V(D)J富集建库

采用5′端模板转换策略进行逆转录，靶向富集BCR V(D)J序列——覆盖重链（IgH V-D-J区）与轻链（IgK/IgL V-J区）全长可变区，同步解析抗体亚型信息与SHM位点。可同步构建scRNA-seq文库，实现克隆与转录组的同步捕获。经文库制备与样本索引后完成建库。

（3）高通量测序与数据分析

采用Illumina平台完成文库测序。经质控过滤、UMI去重及VDJ序列比对（参考IMGT数据库），完成BCR重链/轻链序列重建与克隆型（clonotype）注释，输出每个细胞的天然配对BCR信息，并解析亚型分布、SHM频率与克隆谱系，进而开展系统性免疫组库多维分析（详见第五节）。

图1 单细胞BCR测序技术流程图

3. 技术特色与优势

（1）天然VH-VL配对

在单细胞分辨率下精确获取每个B细胞重链与轻链的天然配对序列，克服Bulk BCR-seq无法确定重-轻链天然配对的根本局限，为抗体特异性验证、功能研究及工程化改造提供精准分子基础。

（2）全长V(D)J序列覆盖

完整覆盖BCR可变区（IgH V-D-J区、IgK/IgL V-J区），包含CDR1-CDR3全区域信息，并同步捕获抗体亚型（IgM/IgG/IgA等）与体细胞超突变（SHM）数据，优于仅覆盖CDR3的短片段方案，利于序列还原、数据库比对及后续功能验证。

（3）克隆谱系与亲和力成熟解析

在单细胞精度下重建克隆家族谱系树，追踪同源克隆的突变积累与亲和力成熟过程，揭示B细胞在免疫应答中的克隆进化规律与类别转换路径。

（4）克隆型与表型精准联动

可与同一平台的scRNA-seq文库联合分析，将BCR克隆型信息与细胞表型（如初始B细胞、记忆B细胞、浆细胞亚群等）直接对应，实现"克隆型—亚型—表型—功能"多维整合解析。

（5）高分辨率克隆动态追踪

通过UMI校正与单细胞级分辨率，支持不同时间点、不同组织来源样本间克隆扩增动态的精准定量比较，适用于治疗前后、免疫应答过程中克隆变化的纵向分析。

（6）标准化分析流程，结果可重复

建立覆盖上游数据处理（Cell Ranger VDJ）至下游免疫组库分析（scRepertoire等主流工具）的标准化流程，多样性指标计算方法及可视化输出规范统一，确保跨样本、跨批次结果可比。

适用范围说明：本服务需要高活性单细胞悬液（活率≥80%，新鲜或合规冻存），不适用于FFPE样本、已裂解RNA、基因组DNA（gDNA）或固定细胞。通量为数千至上万细胞级别，稀有克隆检出率取决于上样细胞数。如需大批量、低成本的整体BCR克隆谱系普查，可考虑Bulk BCR-seq方案；如无需单细胞配对而仅需全面无偏的组库多样性分析，可考虑BCR 5'RACE全长测序方案。

4. 应用场景

抗体药物发现：在单细胞分辨率下获取天然配对VH-VL序列，直接作为治疗性/中和抗体克隆与表达验证的起始序列，是抗体药物研发的核心数据来源。

疫苗免疫应答研究：解析接种或感染后抗原特异性B细胞克隆的扩增规律、亲和力成熟轨迹与亚型转换，辅助中和抗体克隆鉴定与疫苗免疫机制研究。

B细胞肿瘤分析：结合转录组数据，解析肿瘤浸润B细胞（TIL-B）中克隆扩增程度与功能状态（活化、耗竭、调节性亚群）的对应关系，辅助肿瘤免疫微环境及免疫检查点治疗机制探索。

自身免疫与感染免疫研究：解析疾病相关B细胞克隆的扩增规律与特异性BCR序列，支持致病克隆鉴定与疫苗/治疗应答评估。

细胞治疗产品表征（研究）：针对B细胞导向CAR-T等细胞治疗产品，在单细胞分辨率下确认导入受体的链配对完整性，解析产品中伴随B细胞克隆构成与表型分布，支持符合监管要求的产品表征数据建设。

克隆性监测与长期随访：在细胞治疗或基因治疗产品的长期随访场景中，追踪特定B细胞克隆的动态变化，为克隆性扩增风险评估提供精细化数据。

5. 报告与交付内容

报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库分析的完整内容，核心分析模块包括：

· 测序质控与细胞过滤统计（UMI分布、有效细胞数、重链/轻链配对率）

· 配对克隆型（VH-VL）鉴定、计数与频率统计

· 克隆多样性指标（Shannon熵、Gini系数、克隆扩增指数等）

· V/D/J基因使用频率分析（频率分布与基因组合规律）

· CDR3序列特征分析（长度分布、氨基酸组成及序列基序）

· 抗体亚型分布（IgM/IgG/IgA/IgD/IgE）与类别转换分析

· 体细胞超突变（SHM）频率分布与热点分析

· 克隆谱系树构建（同源克隆家族亲缘关系与突变积累）

· 克隆扩增图谱与高扩增克隆TOP列表及序列信息

· 样本间共享克隆分析与时序克隆追踪（多样本时适用）

· （可选）克隆型与表型联合分析：整合scRNA-seq数据，在细胞亚群UMAP投影中叠加克隆型信息

· （可选）候选抗体序列输出：配对VH-VL序列列表，供下游抗体克隆与表达验证使用

交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细信息表（Excel/CSV，含每个细胞的配对BCR序列、V/D/J基因注释、亚型、SHM频率及克隆频率）+ 原始测序数据（FASTQ）

图2 主要分析输出示例概览

6. 服务流程

*服务周期：标准流程25-30个工作日

7. 样本要求

*注：具体活率要求、目标细胞数及运输要求以最新《送样信息单》为准；活细胞样本时效性强，请提前预约并确认方案。如需同时开展流式分选、抗原特异性富集或细胞激活等前处理，可根据项目需求灵活组合。

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.

[2] 国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022年第30号通告.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry. 2020.

[4] U.S. Food and Drug Administration. Hematological Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment; Guidance for Industry. 2020.