BCR-多重PCR测序
BCR-多重PCR测序
1. 背景介绍
B细胞受体（BCR）及其分泌形式——抗体——的克隆多样性是体液免疫应答的核心。BCR由重链（IgH）和轻链（κ或λ）组成，其可变区经V(D)J重排与体细胞超突变（SHM）不断演化，形成高度个体化的免疫组库。解析BCR克隆组成与动态变化，对B细胞肿瘤的克隆性判定、微小残留病灶（MRD）监测及抗体药物的前期研究均具有重要意义。多重PCR法以覆盖免疫球蛋白V、J基因的引物组直接扩增IgH及轻链重排区，兼容gDNA与FFPE，是同类方法中样本兼容性最广、定量最为稳健的技术路线。
该路线已拥有明确的监管先例：clonoSEQ（Adaptive Biotechnologies）作为首个、亦是目前唯一获FDA批准（De Novo，DEN170080）的基于NGS的MRD体外诊断，正是以多重PCR + NGS、基于gDNA检测免疫球蛋白基因重排为核心技术，适用于多发性骨髓瘤、B-ALL与CLL的MRD定量，并已被NCCN指南收录。EuroClonality-NGS联盟基于BIOMED-2引物体系建立的IG重排NGS标准化方案，则进一步确立了该路线在克隆性判定与MRD研究中的国际标准地位。
舒桐科技提供从样本质检、多重PCR建库、高通量测序到系统生物信息分析的全流程服务，助力客户以成熟、经济的方式精准解析B细胞克隆动态，为克隆性判定、MRD监测及抗体相关研究提供高质量、可溯源的数据基础。
2. 技术原理
图1 多重PCR扩增免疫球蛋白重排区技术流程图
技术流程分为以下核心步骤：
（1）核酸提取
从待测样本提取基因组DNA（gDNA）或总RNA，并进行质量检测与定量。DNA法对样本兼容性更广，支持FFPE及部分降解样本；RNA法可结合恒定区引物，更易区分亚型（isotype）。
（2）多重PCR扩增建库
采用覆盖IgH（及κ/λ轻链）V/J基因的多重引物组（沿BIOMED-2/EuroClonality-NGS引物策略），直接扩增重排CDR3区（含部分V区，如FR1/FR2/FR3区段）。第一轮PCR完成靶向扩增后，第二轮PCR加入测序接头与样本唯一索引（UDI），完成文库构建；经文库质控与定量后等量混样。
（3）高通量测序与数据分析
采用Illumina平台完成测序，读取CDR3序列。经质控过滤、序列比对（参考IMGT数据库）完成克隆型鉴定与定量，进而开展系统性免疫组库多维分析。
3. 技术特色与优势
· 样本兼容广：支持gDNA、FFPE及珍稀样本（DNA法），是同类方法中兼容性最强的路线之一。
· 定量稳健：DNA法下一个B细胞通常携带一份重排模板，可按细胞当量准确估算克隆频率。
· 监管成熟：与FDA已批准的clonoSEQ（DEN170080）同路线（多重PCR + NGS，基于gDNA），监管接受度高。
· 灵敏度高：适合B细胞克隆性判定及MRD相关研究。
· 成本与周期友好：流程标准化，可规模化操作。
适用边界说明：引物效率差异可带来一定扩增偏好；B细胞体细胞超突变（SHM）可能落在V区引物结合位点，导致部分克隆扩增效率下降，是BCR多重PCR的固有局限。亚型信息在gDNA法下较难获得（RNA法 + 恒定区引物更易区分）。本路线以CDR3为主、非全长，且为Bulk测序（不提供VH–VL配对）。如需全长序列、亚型信息、SHM分析或重链-轻链配对，建议选用BCR 5'RACE全长测序或单细胞BCR免疫组库测序。
4. 应用场景
· B细胞肿瘤克隆性与MRD研究：克隆性判定、优势克隆追踪（科研用途）。
· 免疫监测与克隆追踪：治疗前后、不同时间点的B细胞克隆动态分析。
· FFPE回顾性研究：利用存档组织样本开展队列分析。
· 抗体药物研发支持：解析B细胞克隆的扩增规律，辅助抗体序列发现的前期研究。
图2 BCR克隆性评估与MRD动态监测示意图
5. 报告与交付内容
报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库分析的完整内容，核心分析模块包括：
分析模块 | 内容 |
数据质控 | reads质量统计与过滤 |
克隆型（CDR3） | 克隆型鉴定与定量 |
多样性与克隆性 | 多样性指数；克隆性/不均一度 |
基因使用频率 | IGHV/IGHJ（及轻链）使用频率分布 |
CDR3特征分析 | CDR3长度分布与氨基酸组成 |
亚型分布（RNA法） | 同型（isotype）分布（如适用） |
优势克隆与追踪 | Top克隆列表、样本间共享克隆与动态追踪 |
交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细数据表（Excel/CSV）+ 原始测序数据（FASTQ）。
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 根据研究目的、样本类型及分析需求，制定个性化建库测序与生信分析方案 |
样本接收与质检 | 对送检样本进行核酸质量检测、浓度定量及质控评估 |
多重PCR建库 | 核酸提取/QC → 多重PCR扩增 → 接头连接与索引添加 → 文库质控 |
高通量测序 | 采用Illumina平台完成测序，按样本数与文库类型配置测序量 |
生物信息分析 | 克隆型鉴定、多样性分析、基因使用频率及可视化 |
报告交付与技术支持 | 提供完整分析报告（PDF）及克隆型数据文件，并提供后续技术咨询 |
7. 样本要求
服务项目 | 送样要求 |
基因组DNA（gDNA） | 推荐；定量稳健，兼容FFPE及多种来源样本 |
总RNA（可选） | 需RIN值合格；RNA法 + 恒定区引物可更易区分亚型，采血勿用肝素抗凝 |
FFPE组织 | 多重PCR兼容；核酸质量影响灵敏度与定量 |
细胞/新鲜组织 | 可代为提取核酸；活率与细胞数以《送样信息单》为准 |
*注：具体起始量及运输要求以最新《送样信息单》为准；送样前建议先沟通确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | Illumina |
起始模板 | gDNA或RNA（含FFPE，DNA法） |
覆盖范围 | CDR3（含部分V区），非全长 |
检测对象 | IgH（默认）；κ/λ轻链可按需 |
亚型 | RNA + 恒定区引物可区分（gDNA法有限） |
定量特性 | DNA法可估算细胞当量/克隆频率 |
支持物种 | 人；小鼠等另询 |
9. 参考文献
[1] U.S. Food and Drug Administration. Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products. 2020.
[2] Adaptive Biotechnologies. clonoSEQ Assay — FDA De Novo Authorization DEN170080. 2018.
[3] van Dongen JJ, et al. EuroClonality-NGS Working Group. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations. Leukemia. 2003.
[4] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.