BCR-5'RACE全长测序

BCR-5'RACE全长测序

1. 背景介绍

B细胞受体（B Cell Receptor，BCR）及其分泌型抗体由免疫球蛋白重链（IgH）与轻链（Igκ/Igλ）组成，通过V(D)J基因重组、连接区核苷酸增删、体细胞超突变（Somatic Hypermutation，SHM）及类别转换重组（Class Switch Recombination，CSR）四重机制构建近乎无限的多样性，是体液免疫识别抗原、抗体亲和力成熟与免疫记忆形成的分子基础。全长可变区序列承载了抗体特异性的完整信息，并可与恒定区联合解析抗体亚型（IgM/IgG/IgA/IgD/IgE）、SHM水平及克隆谱系演化，是抗体药物发现、疫苗免疫原性评估与B细胞肿瘤研究不可或缺的数据基础。

基于RNA的5'RACE技术借助SMART模板转换在cDNA 5'端引入通用接头，仅用一对引物即可扩增覆盖所有IGHV/IGKV/IGLV基因家族的全长可变区，规避多重PCR引物效率差异导致的扩增偏好；联合12-nt UMI实现PCR重复去除与测序错误纠正，使克隆丰度定量更接近真实分子计数。同时，恒定区信息的保留使抗体亚型鉴定与类别转换分析成为可能，全长覆盖则为SHM精细定位与克隆谱系树构建提供完整序列依据。

在监管与行业层面，FDA《Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment》（2020）确认基于NGS的免疫球蛋白重排检测可用于MRD评估；目前已获FDA批准的clonoSEQ检测（De Novo，DEN170080）基于NGS免疫受体重排原理，已被NCCN指南收录用于多发性骨髓瘤、B-ALL与CLL；EuroClonality-NGS联盟在BIOMED-2引物体系基础上建立了IG重排NGS标准化方案。FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）与《Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products》（2020）对靶向B细胞的CAR-T等产品的克隆构成与长期随访提出明确要求。基于RNA的全长 + 亚型 + UMI路线可为抗体药物开发、疫苗与体液免疫研究提供高分辨率、可复现的克隆型数据。

珠海舒桐医疗科技有限公司提供从样本质控、cDNA合成与文库构建、高通量测序到系统免疫组库与抗体特征生物信息分析的全流程服务，助力客户在全长分辨率下精准刻画BCR克隆动态、抗体亚型分布与体细胞超突变演化轨迹。

2. 技术原理

本服务基于SMART模板转换与5'RACE策略，以总RNA为起始模板，通过半巢式PCR富集BCR全长V(D)J序列，并在文库构建早期引入12-nt UMI以实现单分子定量。核心步骤如下：

（1）RNA起始与逆转录

以高质量总RNA（RIN≥7）为模板，oligo-dT引导逆转录合成第一链cDNA，覆盖含poly(A)尾的免疫球蛋白转录本。

（2）SMART模板转换与UMI引入

逆转录酶在cDNA 5'端发生模板转换，引入含12-nt UMI的通用接头序列，每条原始mRNA分子获得唯一分子标识，为后续去重纠错奠定基础。

（3）半巢式PCR富集与亚型区分

PCR1以通用5'接头与免疫球蛋白恒定区特异性引物（IgM/IgG/IgA/IgD/IgE/Igκ/Igλ）进行选择性扩增，恒定区引物的设计同步实现亚型与类别转换分析；PCR2在两端加入UDI双端样本索引及Illumina测序接头。

（4）高通量测序与数据分析

采用Illumina平台2×300 bp双端测序覆盖全长V(D)J；经UMI去重、错误校正与IMGT/MiXCR比对，完成IgH/Igκ/Igλ克隆型重建、亚型分布、SHM定位与克隆谱系树构建（详见第五节）。

图1 BCR 5'RACE全长测序技术流程图

3. 技术特色与优势

（1）无偏全长扩增

单对引物覆盖全部IGHV/IGKV/IGLV基因家族，从根本上规避多重PCR的引物偏好性；完整覆盖FR1–FR4 + CDR1–CDR3全部可变区，为SHM精细定位、克隆谱系分析与候选抗体序列挖掘提供完整序列基础。

（2）抗体亚型与类别转换解析

通过恒定区特异性引物同步区分IgM/IgG/IgA/IgD/IgE五种重链亚型，定量分析亚型分布与类别转换重组动态，为体液免疫应答阶段判定与疫苗免疫原性评估提供关键数据。

（3）SHM与克隆谱系分析

全长可变区覆盖支持体细胞超突变率精确计算、突变位点定位及亲和力成熟轨迹解析；进一步可构建克隆谱系树（lineage tree），还原同一祖先克隆的进化关系。

（4）UMI精准定量与纠错

12-nt UMI提供约1700万种分子标签组合，对PCR复制偏差与测序错误进行系统校正，避免错误读数被误判为新克隆或新SHM位点而人为放大多样性。

（5）重链与轻链可选检测

支持IgH（重链）及Igκ/Igλ（轻链）单独或同步检测；如需VH–VL天然配对以直接克隆功能性抗体，可选择单细胞BCR测序方案。

（6）标准化分析流程

建立从UMI去重、克隆型重建（MiXCR/IgBLAST/IMGT）到亚型分布、SHM分析、克隆谱系构建及可视化输出的标准化流程，确保跨样本、跨批次结果可比，原始FASTQ全程交付。

适用范围说明：本服务以RNA为起始模板，要求RIN≥7的高质量总RNA；不适用于FFPE样本、纯gDNA或已严重降解的RNA。如样本类型为gDNA或FFPE，建议选择BCR多重PCR测序方案。

4. 应用场景

抗体药物开发：从全长BCR组库中挖掘候选抗体可变区（VH/VL）序列，结合SHM水平与亲和力成熟轨迹筛选高亲和力候选；如需天然配对VH–VL序列以直接克隆表达，可联合单细胞BCR方案。

疫苗免疫原性研究：解析疫苗接种前后抗体克隆扩增、亚型转换（如IgM→IgG）与SHM水平变化，定量评估疫苗诱导体液免疫应答的强度、广度与成熟度。

自身免疫与感染免疫：识别并追踪致病性自身反应性B细胞克隆或保护性中和抗体克隆，解析疾病相关BCR基序与公共抗体克隆。

B细胞肿瘤克隆性与谱系研究：用于多发性骨髓瘤、B-ALL、CLL、淋巴瘤等B细胞恶性疾病的克隆性判定、肿瘤起源克隆识别与克隆演化轨迹研究（科研用途）。

细胞治疗与长期随访：针对靶向B细胞的CAR-T等治疗产品，监测B细胞重建动态、抗体应答恢复及伴随克隆构成变化，支持产品表征与长期随访研究。

5. 报告与交付内容

报告涵盖从测序质控到系统性免疫组库与抗体特征分析的完整内容，核心分析模块包括：

·测序数据质控与UMI去重统计（reads质量、比对率、UMI分布、有效分子数）

·克隆型鉴定与定量（UMI校正后的IgH/Igκ/Igλ克隆型表、频率分布）

·克隆多样性与克隆性指标（Shannon熵、Simpson指数、Chao1、Gini系数等）

·V/D/J基因使用频率分析（IGHV/IGHD/IGHJ及轻链频率与基因组合规律）

·CDR3序列特征分析（长度分布、氨基酸组成与序列基序）

·抗体亚型分布与类别转换分析（IgM/IgG/IgA/IgD/IgE比例及转换关系）

·体细胞超突变（SHM）率分析（V区突变频率、突变位点分布与R/S比）

·克隆谱系树（lineage tree）构建与同源克隆家族分析

·Top优势克隆排名、完整克隆型序列信息与样本间共享克隆分析

·（可选）数据库（IMGT、抗体数据库）比对、候选抗体序列筛选与定制化可视化

交付物：图文分析报告（PDF）+ 克隆型详细信息表（Excel/CSV，含V/D/J基因注释、CDR3核酸/氨基酸序列、亚型注释、SHM率、UMI计数及克隆频率）+ 原始测序数据（FASTQ）。

图2 BCR抗体亚型分布与克隆谱系演化示意图

6. 服务流程

7. 样本要求

*注：RNA需溶于无核酸酶水、不得含poly(A) carrier；采血请勿使用肝素抗凝；细胞建议以Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS洗涤≥2次，不可使用固定细胞；避免反复冻融，建议按2–3倍余量送样；干冰全程冷冻运输。具体送样要求以最新《送样信息单》为准，送样前请预约并确认方案。本服务不适用于FFPE样本、纯gDNA或已严重降解的RNA。

8. 技术参数

9. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment; Guidance for Industry. 2020.

[2] U.S. Food and Drug Administration. Considerations for the Development of CAR T Cell Products; Draft Guidance. 2024.

[3] U.S. Food and Drug Administration. Long-Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry. 2020.

[4] U.S. FDA De Novo Decision Summary DEN170080 (clonoSEQ Assay). 2018; supplemented 2020 (CLL indication).

[5] Scheijen B, et al. Next-generation sequencing of immunoglobulin gene rearrangements for clonality assessment: a technical feasibility study by EuroClonality-NGS. Leukemia. 2019.

[6] 国家药品监督管理局药品审评中心. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 2022年第30号通告.