AAV质粒ITR完整性与对称性分析

AAV质粒ITR完整性与对称性分析

面向AAV cis（载体）质粒的ITR专项序列质控：以PacBio或Nanopore长读长单分子测序贯穿ITR的T形发夹结构，确证两端ITR的完整性、对称性与序列正确性，定位 ITR 区的缺失、重组与翻转，在产毒前拦下会传导成AAV基因组缺陷的质粒批次。

1. 背景介绍

AAV基因组两端各有一段反向末端重复序列（Inverted Terminal Repeat，ITR），约145bp，折叠形成T形发夹二级结构。ITR是Rep蛋白识别复制起点的位置，也是基因组被切割并装入衣壳的边界——没有完整的ITR，就没有合格的AAV基因组。ITR高度回文、富含GC、结构稳定，这一特征恰恰使其在大肠杆菌扩增传代过程中成为重组、缺失与不对称的高发区域;质粒传代越多，ITR残缺或两端不对称的风险越高。

质粒端的ITR缺陷会直接传导为AAV基因组的截短与包装异常，削弱滴度与转导效率并抬高产物异质性;但常规检测手段难以给出明确结论：Sanger测序读到发夹结构往往停滞或读错，酶切只能间接判断ITR大致存在，均无法回答“ITR是否完整、两端是否对称、序列是否正确”。

健康的AAV cis质粒应保证5′与3′两端ITR互为镜像、长度与序列一致;一旦一端ITR发生缺失或部分重组，两端不再对称，会影响复制与包装效率及基因组完整性。因此对ITR不仅要看“在不在”，更要看“两端一不一样”。

在监管与行业层面，ITR作为AAV关键功能元件与公认CQA，其完整性与序列正确性已有明确依据：ICH Q5B（表达构建体分析与遗传稳定性）、Q6B（质量标准）、Q2（R2）（方法验证）；FDA《CMCInformationforHumanGeneTherapyINDs》（2020）将生产用质粒作为起始物料/关键试剂进行控制;中国CDE《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022）要求明确起始物料（含质粒）的序列正确性、关键质量属性与控制策略。本服务以ITR专项确证为上述方向提供CQA级数据支撑。

图1. AAV ITR二级结构与质粒ITR缺陷向AAV基因组的传导示意图

2. 技术原理

本服务以长读长单分子测序（PacBio/Nanopore）为核心，以客户提供的ITR设计/质粒全序列为定制参考，对AAV cis质粒两端ITR区进行专项比对与解析。单分子长读可一次性贯穿T形发夹二级结构，避免常规测序在回文/发夹区停滞或读错，使ITR区的缺失、部分重组与翻转等结构性事件可被直接定位；同时对5′与3′两端ITR分别评估完整性与序列正确性，并进行对称性比对。核心步骤如下：

（1）样本接收与质检

接收AAV cis质粒DNA，评估浓度、纯度与初步完整性（如超螺旋形态），确认满足建库要求。

（2）长读长文库构建

按PacBio或Nanopore平台制备长读文库，采用利于覆盖ITR高结构区与全质粒的策略。

（3）长读长测序

在PacBio或Nanopore平台运行至目标深度；可按低频ITR事件的检出需求提升测序深度。

（4）生物信息分析与序列判读

以客户ITR/质粒序列为定制参考进行比对，逐条解析两端ITR的完整性、对称性、缺失/重组/翻转事件的位点与占比，以及相对设计参考的SNV/插入缺失，出具ITR专项确证报告。

图2. AAV质粒ITR完整性与对称性分析技术流程图

3. 技术特色与优势

（1）贯穿发夹的长读覆盖

单分子长读可一次性读过ITR的T形发夹结构，弥补Sanger与短读在回文/发夹区的盲区与歧义，使ITR缺失、部分重组、翻转等事件直接呈现。

（2）两端对称性专项比对

对5′与3′两端ITR分别评估完整性与序列，并进行长度/序列一致性的对称性比对，可靠回答“两端是否对称、不对称在哪里”。

（3）双平台互补

PacBioHiFi提供高单碱基精度，适合ITR区序列细微变异与低频异质性检出；Nanopore提供超长读与快速周转，适合结构/重组筛查与建库确证；两平台可按需单用，或正交合用相互印证。

（4）客户设计图定制比对

以客户提供的ITR设计/质粒全序列为定制参考逐条比对，报告与设计参考的每一处差异，结论可量化、带位点、可比较。

（5）源头—成品证据链联用

可与颗粒层面AAV基因组完整性与ITR分析对照，形成“质粒ITR→AAV基因组ITR”的源头—成品对应证据，辅助定位异质性来源。

4. 应用场景

AAVcis质粒库建库确证：作为cis质粒主库/工作库（MCB/WCB）的ITR序列基线，用于建库放行与跨批比较。

构建优化/血清型切换后核实：在载体设计、构建优化或血清型切换后核实两端ITR的完整性、对称性与序列正确性。

生产前cis质粒放行：在产毒前完成质粒ITR专项确证，避免源头ITR缺陷传导至下游AAV基因组的截短/包装异常。

工艺/供应商变更比对：在工艺或质粒供应商变更前后进行ITR一致性比对，支撑变更评估。

IND/BLA起始物料表征：为注册申报提供AAV起始物料（cis质粒）的ITR完整性与对称性证据。

5. 报告与交付内容

报告给出可量化、带位点、可比较的ITR序列证据，而非单一“合格/不合格”结论，核心内容包括：

·两端ITR完整性判定：5′与3′ITR是否完整，含覆盖度与可信度评估；

·ITR事件谱：缺失/部分重组/翻转等事件的位点、类型与占比；

·对称性评估：5′ vs 3′ITR的长度/序列一致性比较，标注不对称区域；

·ITR序列差异清单：相对设计参考的SNV/插入缺失（适用时含异质性占比）；

·可执行建议：针对差异给出重挑克隆/更换质粒批/锁定ITR完整的质粒库等方向；

·可执行建议：针对差异给出重挑单克隆 / 修正构建 / 锁定质粒库等方向；

·数据交付：完整分析报告（PDF）、序列比对/差异数据文件与原始测序数据；

·（可选）与颗粒层面AAV基因组完整性与ITR分析联用，形成源头—成品证据链。

6. 服务流程

7. 样本要求

*具体送样要求以最新《送样指南》为准；本服务不适用于已严重降解的样本。送样前请预约并确认方案。

8. 技术参数

9. 参考文献

[1] International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). Q5B: Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of r-DNA Derived Protein Products. Current Step 4 version, 30 November 1995.

[2] ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological / Biological Products. Current Step 4 version, 10 March 1999.

[3] ICH. Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Step 4 version, adopted 1 November 2023.

[4] U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs); Guidance for Industry. Final, January 2020. (Docket No. FDA-2008-D-0205)

[5] 国家药品监督管理局药品审评中心(CDE). 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行). 通告 2022 年第 31 号, 2022 年 5 月 26 日发布.

[6] Wright J F. Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: characterization and risk assessment. Biomedicines, 2014, 2(1): 80–97.

[7] Tai P W L, Xie J, Fong K, et al. Adeno-associated virus genome population sequencing achieves full vector genome resolution and reveals human-vector chimeras. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2018, 9: 130–141.