载体全长转录本分析
载体全长转录本分析
以靶向捕获富集结合 PacBio Iso-Seq 长读长全长 cDNA 测序，在转录层面鉴定载体相关的全长 isoform、宿主—载体融合转录本、可变剪接与 3′ 端使用，为转基因表达完整性与插入安全性提供单分子级证据。
1. 背景介绍
载体整合进宿主基因组后，会被转录成 RNA 并进一步翻译成蛋白（如 CAR）。但整合区是一个开放的基因组环境，转录并不总是规规矩矩，常见的转录层面风险包括以下几类。
一是宿主—载体融合转录本（VECTOR∷host）。转录可能从载体读穿到邻近的宿主基因，或从宿主基因读进载体，形成嵌合的融合 RNA，既可能影响 CAR 表达，也是评估插入是否影响邻近基因的转录层面证据。二是隐性 polyA 导致的 3′ 异常，使转录提前终止，影响转录本完整性。三是可变剪接（alternative splicing），同一段基因可剪接出多个 isoform 版本，需要确认主导版本是否就是设计的功能转录本。
isoform 指同一基因经不同剪接或起止位点产生的不同 RNA 版本。在载体相关转录层面，核心问题是：功能性全长转录本占比多少、是否存在异常或融合版本。短读测序擅长定量与位点精度，但难以独立还原从 5′ 到 polyA 的完整转录本结构与融合连接，这正是长读长 Iso-Seq 的用武之地。
图1. 宿主—载体融合转录本与异常 isoform 示意图
在监管与行业层面，转录本鉴别与表达完整性表征有明确依据：ICH Q6B 要求含鉴别在内的质量标准与接受标准；FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（终版，2024）要求对鉴别、效价与安全性作出评估，并关注插入诱变风险；中国 CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022）对 CAR-T 等产品的药学研究与安全性提出明确要求。本服务为上述方向提供转录层面的表征数据。
2. 技术原理
本服务以靶向捕获富集结合 PacBio Iso-Seq 长读长全长 cDNA 测序为核心。靶向捕获采用按客户载体定制的探针富集载体相关转录本，作为本服务内含步骤；Iso-Seq 单条 read 覆盖从 5′ 到 polyA 的完整转录本，免拼接直接给出 isoform 结构、融合连接、可变剪接与 3′ 端使用信息。核心步骤如下：
（1）样本接收与质检
接收细胞渣或已提取 RNA，评估 RNA 浓度、纯度与完整性（如 RIN/DV200），确认满足建库要求。
（2）全长 cDNA 合成与定制探针捕获富集
合成全长 cDNA，按客户载体序列定制探针对载体相关转录本进行靶向捕获富集，提高有效信号比例。
（3） PacBio HiFi测序
在 PacBio HiFi 平台运行至目标深度，单分子长读长完整覆盖转录本结构。
（4）生物信息分析与结果判读
以客户载体序列与人参考基因组为定制参考进行比对，鉴定全长 isoform、识别融合连接、解析可变剪接与 3′ 端使用，出具转录本表征报告。
图2. 靶向捕获 + PacBio Iso-Seq 技术流程图
3. 技术特色与优势
（1）单分子全长免拼接
一条 read 完整覆盖从 5′ 到 polyA 的转录本，免拼接直接呈现 isoform 结构与融合连接，避免短读拼接歧义。
（2）融合转录本可定位
可识别并定位宿主—载体融合转录本的连接位点，是评估插入是否影响邻近基因表达的关键转录层面证据。
（3）剪接与 3′ 端使用全景呈现
解析可变剪接事件与 3′ 端使用，发现隐性 polyA 导致的提前终止与异常 isoform。
（4）以客户载体为定制参考
以客户提供的载体全序列为定制参考逐条比对，结论可量化、带位点、可比较。
（5）与 DNA 层面证据互补
可与载体整合位点与整合体结构分析联合解读，形成“整合在哪 + 转出什么”的完整安全性论证。
4. 应用场景
转基因表达完整性表征：确认主导全长 isoform 与设计一致，排除截短或异常版本。
插入安全性的转录层面证据：识别宿主—载体融合转录本，与整合位点 DNA 证据互证。
载体设计优化核实：在载体设计或工艺优化后核实转录层面的改进效果。
IND/BLA 申报数据支撑：为注册申报提供转录本鉴别与表达完整性证据。
5. 报告与交付内容
报告给出可量化、带位点、可比较的转录层面证据，核心内容包括：
·载体相关全长 isoform 的结构与丰度，含功能性全长占比与异常版本清单。
·宿主—载体融合转录本的识别与连接位点定位。
·可变剪接事件与 3′ 端使用分析。
·与整合位点或整合体结构分析的关联解读（可选，联合解读时提供）。
·数据交付：完整分析报告（PDF）、isoform 与融合事件结果文件、原始测序数据。
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 根据载体类型、研究阶段及监管目标，制定靶向捕获与测序方案 |
| 探针定制 | 按客户载体序列定制液相捕获探针（本服务内含步骤） |
样本接收与质检 | 评估 RNA 浓度、纯度与完整性 |
| 全长 cDNA 合成与捕获文库制备 | 富集载体相关转录本制备PacBio长读文库 |
PacBio HiFi测序 | 在 PacBio HiFi 平台运行至目标深度 |
生物信息分析 | 以客户载体序列为定制参考，解析 isoform、融合、剪接与 3′ 端 |
报告交付与技术支持 | 提供完整分析报告（PDF）、整合位点列表与原始数据，并提供后续技术咨询 |
7. 样本要求
项目 | 送样要求 |
样本类型 | 细胞渣或已提取的 RNA |
推荐起始量 | 建议总 RNA ≥ 5 μg（具体以《送样指南》为准，建议按最低起始量留足余量） |
浓度与质量 | 建议 RNA 浓度 ≥ 50 ng/μL；OD260/280 ≈ 1.8-2.1；RIN ≥ 7 或 DV200 ≥ 70%，无明显降解 |
| 保存与运输 | -80 ℃ 冻存，干冰全程冷链运输 |
*具体送样要求以最新《送样指南》为准；本服务不适用于已严重降解的样本。送样前请预约并确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | PacBio HiFi（长读长单分子测序） |
读长策略 | 单条 read 覆盖完整转录本（从 5′ 到 polyA） |
富集方式 | 按客户载体定制探针的靶向捕获（本服务内含） |
适用样本 | 细胞渣或已提取 RNA |
比对参考 | 以客户提供的载体全序列与人参考基因组为定制参考 |
| 检出能力 | 全长 isoform 结构、宿主—载体融合转录本、可变剪接、3′ 端使用 |
测序深度 | 按目标灵敏度设定，低丰度 isoform 与融合事件的检出依测序深度而定 |
| 方法状态 | IND：方法确认（fit-for-purpose）；BLA：依ICH Q2（R2）完整验证 |
支持物种 | 以人源细胞为主，其他物种依客户载体序列定制 |
9. 参考文献
[1] ICH. Q6B: Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products. Current Step 4 version, 10 March 1999.
[2] ICH. Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Step 4 version, adopted 1 November 2023.
[3] U.S. Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products. Final, January 2024. (Docket No. FDA-2021-D-0404)
[4] 国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）. 免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）. 通告 2022 年第 11 号，2022 年发布。