KIR/HLA基因分型（长读长测序）
KIR/HLA基因分型（长读长测序）
面向异体/现货型 CAR-NK 与细胞治疗产品的供者精细分型与起始物料确证：以单分子长读长测序（PacBio HiFi / Oxford Nanopore）直接读出 KIR 基因的完整序列，跨越高度同源的旁系基因与结构变异，直接获得等位基因级别基因型与着丝粒/端粒完整单体型，并给出 B 含量评分与 KIR–HLA 配体配对，为主细胞库（MCB）/起始物料的参考级免疫遗传学表征、二代结果确证及 IND/BLA 注册申报提供高分辨证据。
1. 背景介绍
自然杀伤（NK）细胞依靠杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）等受体识别 HLA class I，并据抑制/激活信号的净结果决定杀伤。在异体/现货型 CAR-NK 与细胞治疗中，供者 KIR 与 HLA 基因型共同决定 NK 的同种反应性与“教育”状态，是供者选择与免疫遗传学表征的核心变量。KIR 基因座位于 19 号染色体 19q13.4，是人类基因组中结构最复杂、多态性最高的区域之一，单体型在基因数目与结构上差异极大。
临床证据已将这一机制落到实处：单倍体移植中 KIR-配体错配与白血病复发减少相关（Ruggeri 等，2002）；以 B 含量评分挑选无关供者改善 AML 移植预后且具疾病特异性（Cooley 等，2010）；脐血来源 CAR-NK 早期临床显示良好缓解率与安全性（Liu 等，2020）。与此同时，KIR（19 号染色体）与 HLA class I（6 号染色体）相互独立、并不连锁，KIR 必须与 HLA 联合解读；相关关联为关联性、具疾病特异性的证据，不构成对产品功效的承诺。
KIR 是人类基因组中最难精确分型的区域之一：基因家族高度同源、拷贝数可变，并存在缺失、重复与融合（如 KIR3DL1/2v）等结构变异。短读长测序难以在高度相似的旁系基因之间正确归属读段，也无法在长距离上确定相位，因而对 KIR2DL5A/B、KIR2DS1 与 KIR2DL1、KIR3DL1 与 KIR3DS1 等的判读及着丝粒/端粒单体型的拼接存在歧义。单分子长读长可跨越完整基因区，直接解开旁系基因归属、呈现结构变异并重建相位：已有研究显示，基于长片段 PCR 的 Oxford Nanopore 方案覆盖除 KIR3DP1 外的全部 KIR 基因，其等位基因判读与已发表数据一致性达 97.2–99.5%、与 PCR-SSP 的基因含量一致性 >99.7%，并可解决相位歧义（Downing 等，2025；Downing 与 D'Orsogna，2022）。
在监管层面，KIR/HLA 分型并非法规强制的放行属性，而是供者选择与起始物料/主细胞库免疫遗传学背景表征的科学输入。三代长读长可提供参考级别的等位基因与单体型证据，适用于确证与高要求场景。本服务可在 FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）、ICH Q5D（细胞基质表征）、ICH Q2(R2)（分析方法验证）及中国 NMPA（2017）与 CDE（2022）相关指导原则框架下作为支持性证据；方法可按研究阶段以 fit-for-purpose 确认或依 ICH Q2(R2) 完整验证。
2. 技术原理
本服务以单分子长读长测序（PacBio HiFi / Oxford Nanopore）直接读出 KIR 基因的完整序列为核心，以 IPD-KIR/IPD-HLA 为参考等位基因库，跨越同源旁系基因与结构变异，直接获得等位基因级别基因型与着丝粒/端粒完整单体型。核心步骤如下：
(1) 样本接收与质检
接收高分子量基因组 DNA 或供者来源细胞；长读长对 DNA 完整性要求更高，重点评估片段大小与降解情况。
(2) 文库制备
可选两条路线：① 长片段 PCR 扩增覆盖除 KIR3DP1 外的全部 KIR 基因后建库（Nanopore 路线）；② 制备长读文库并按需结合靶向富集（PacBio HiFi 路线）。
(3) 长读长测序
PacBio HiFi 以环形一致序列（CCS）获得高单碱基精度的长读，或以 Oxford Nanopore 纳米孔测序；单条长读跨越完整基因区，完整呈现等位基因与结构。
(4) 生信分析与判读
以 IPD-KIR/IPD-HLA 为参考、采用适配长读长的判读流程，进行等位基因级别比对、结构变异识别与相位重建，输出 GL string、着丝粒/端粒完整单体型、拷贝数、B 含量评分与 KIR–HLA 配体配对。
图1. 长读长（PacBio HiFi / Nanopore）KIR 分型技术流程图
3. 技术特色与优势
跨基因单分子读出：长读跨越完整 KIR 基因，免去短读拼接的歧义，直接解开高度同源的旁系基因。
完整相位与单体型：直接重建着丝粒/端粒完整单体型，而非依赖统计推断。
结构变异可及：缺失、重复与融合（如 KIR3DL1/2v）在单条读上完整呈现。
等位基因级最高分辨：PacBio HiFi 提供参考级准确度；Nanopore 长片段 PCR 方案可在常规实验室落地，等位基因一致性 97.2–99.5%。
与二代互补/确证：可作为二代捕获结果的确证层，或独立提供参考级分型。
4. 应用场景
主细胞库 / 起始物料确证：参考级 KIR/HLA 等位基因分型与完整单体型建档。
现货型 CAR-NK 供者精细分型：在需要相位或完整单体型时提供高分辨结果。
二代结果确证：对短读长难分的高同源基因与结构变异做长读长确证。
新等位基因/结构变异鉴定：支持科研发现与数据库贡献。
IND/BLA 表征：为细胞治疗产品提供参考级免疫遗传学证据。
5. 报告与交付内容
报告以高分辨、带单体型、可比较的免疫遗传学证据为核心，主要内容包括：
等位基因级别基因型：GL string 格式的高分辨基因型。
完整单体型：着丝粒/端粒（Cen/Tel）完整单体型与 A/B 单体型构成。
结构变异：缺失、重复、融合（如 KIR3DL1/2v）等事件的呈现。
拷贝数：基于长读的 KIR 基因拷贝数。
B 含量评分：由 Cen-B 与 Tel-B 基序数计算（取值 0–4）。
KIR–HLA 配体配对：C1/C2、Bw4、A3/A11 等配体表位归属与错配方向。
HLA class I 分型：如同步开展，提供 HLA-A/B/C 等位基因型。
数据交付：完整分析报告（PDF）、基因型/单体型列表、结构变异文件与原始长读数据。
图2. 长读长 KIR 等位基因、单体型与结构变异结果示意图
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 依研究阶段与监管目标确定平台（PacBio HiFi / Nanopore）、是否同测 HLA 与确证范围，制定方案 |
样本接收与质检 | 评估高分子量基因组 DNA 或细胞样本的浓度、纯度与片段完整性 |
文库制备 | 长片段 PCR（覆盖除 KIR3DP1 外的全部 KIR 基因）或长读文库 ± 靶向富集 |
长读长测序 | PacBio HiFi（CCS 高准确度共识）或 Oxford Nanopore，获取跨基因的长读 |
生物信息分析 | 等位基因级别比对、结构变异识别、相位重建，输出基因型与完整单体型 |
报告交付与技术支持 | 提供完整分析报告（PDF）、基因型/单体型列表与原始数据，并提供后续技术咨询 |
*服务周期：标准流程约 25–35 个工作日；批量样本与加测项目以最终方案为准。
7. 样本要求
项目 | 送样要求 |
样本类型 | 高分子量基因组 DNA（推荐）或供者来源细胞沉淀（外周血单个核细胞/单采细胞/主细胞库样本） |
推荐起始量 | gDNA ≥ 1.5–3 µg（长读长/长片段 PCR 需更高量与完整性）；细胞 ≥ 1×10⁶ |
浓度与纯度 | gDNA 建议 ≥ 50 ng/µL；OD260/280 ≈ 1.8–2.0，主带 ≥ 30 kb，无明显降解 |
配套信息 | 如需 HLA 联检请注明；供者/批次信息如可提供，有助于结果建档 |
保存与运输 | 避免反复冻融与剧烈剪切；细胞：液氮或干冰冷链；gDNA：–20℃ 冻存，干冰运输 |
*具体送样要求以最新《送样指南》为准；长读长对 DNA 完整性敏感，不适用于已严重降解的样本。送样前请预约并确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | PacBio Sequel IIe/Revio（SMRT 单分子长读长，HiFi 模式）或 Oxford Nanopore |
文库策略 | 长片段 PCR（覆盖除 KIR3DP1 外的全部 KIR 基因）或长读文库 ± 靶向富集 |
覆盖基因 | KIR 13 基因（KIR2DL1/2/3/4/5、KIR3DL1/2/3、KIR2DS1–5、KIR3DP1）；HLA-A/B/C 按需 |
分辨率 | 等位基因级别 + 着丝粒/端粒完整单体型 + 结构变异 |
参考库 / 流程 | IPD-KIR、IPD-HLA（对应 release）；适配长读长的等位基因判读流程 |
检出能力 | 等位基因型（GL string）、完整单体型、结构变异、拷贝数、B 含量评分、KIR–HLA 配体 |
一致性 | Nanopore 等位基因一致性 97.2–99.5%，与 PCR-SSP 基因含量一致性 >99.7%（文献） |
核心优势 | 相位与完整单体型直接获得；结构变异在单条读上完整呈现 |
方法状态 | IND：方法确认（fit-for-purpose）；BLA：依 ICH Q2(R2) 完整验证 |
支持物种 | 人源 |
9. 参考文献
[1] Downing J, et al. Allele-level KIR genotyping by long-read Oxford Nanopore sequencing. HLA. 2025;106(3):e70400. doi:10.1111/tan.70400
[2] Downing J, D'Orsogna L. High-resolution human KIR genotyping. Immunogenetics. 2022;74(4):369–379. doi:10.1007/s00251-021-01247-0
[3] Norman PJ, et al. Defining KIR and HLA Class I Genotypes at Highest Resolution via High-Throughput Sequencing. Am J Hum Genet. 2016;99(2):375–391. doi:10.1016/j.ajhg.2016.06.023
[4] Cooley S, Weisdorf DJ, Guethlein LA, et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 2010;116(14):2411–2419. doi:10.1182/blood-2010-05-283051
[5] Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science. 2002;295(5562):2097–2100. doi:10.1126/science.1068440
[6] Liu E, Marin D, Banerjee P, et al. Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors. N Engl J Med. 2020;382(6):545–553. doi:10.1056/NEJMoa1910607
[7] Milius RP, Mack SJ, Hollenbach JA, et al. Genotype List String: a grammar for describing HLA and KIR genotyping results in a text string. Tissue Antigens. 2013;82(2):106–112.
[8] ICH. Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Step 4 version, 2023.
