KIR/HLA基因分型（杂交捕获NGS）
KIR/HLA基因分型（杂交捕获NGS）
面向异体/现货型 CAR-NK 与细胞治疗产品的供者选择与起始物料表征：以溶液相靶向杂交捕获在同一反应内富集全部 13 个 KIR 基因与 HLA class I，经 Illumina 短读长测序并以 KIR 专用流程 PING 判读，一次给出 KIR 基因含量、拷贝数（CNV）、等位基因级别基因型（GL string）、着丝粒/端粒单体型与 B 含量评分，并同步 HLA-A/B/C 分型与 KIR–HLA 配体配对，为供者选择、主细胞库（MCB）/起始物料的免疫遗传学背景表征及 IND/BLA 注册申报提供分子层面证据。
1. 背景介绍
自然杀伤（NK）细胞依靠一组生殖系编码的受体实时决策杀伤与否，其中杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）家族通过识别 HLA class I 分子来传递抑制或激活信号。在异体/现货型 CAR-NK 与细胞治疗中，供者的 KIR 与 HLA 基因型共同塑造 NK 的同种反应性与“教育”状态，是供者选择与产品免疫遗传学表征的核心变量。KIR 基因座位于 19 号染色体 19q13.4，区域长 100–350 kb，单体型携带 4–20 个基因，已知等位基因逾 600 个，是人类基因组中结构最复杂、最具多态性的区域之一。
临床证据将这一机制落到了实处。在单倍体造血干细胞移植中，供者→受者方向的 KIR-配体错配可解除相应 NK 亚群的抑制、产生同种反应，与白血病复发减少相关（Ruggeri 等，2002）；以 B 单体型“B 含量评分”挑选无关供者，可改善急性髓系白血病（AML）的移植预后，且效应具疾病特异性（Cooley 等，2010）。在细胞治疗方向，脐血来源抗 CD19 CAR-NK 的早期临床显示出良好的缓解率与安全性（Liu 等，2020）。需要强调的是：KIR（19 号染色体）与 HLA class I（6 号染色体）相互独立、并不连锁——拥有某个抑制型 KIR（钥匙），只有在已知其 HLA 配体（锁）是否存在时才有意义。因此 KIR 必须与 HLA class I 联合检测，相关关联为关联性、具疾病特异性的证据，不作为对产品功效的预测或承诺。
KIR 分型的难点在于该基因家族高度同源、拷贝数可变，并伴有缺失、重复与融合等结构变异。仅判断基因有无的方法（PCR-SSP/SSO）无法给出拷贝数与等位基因级别信息：已有研究显示，仅就两个 KIR 基因而言，千人基因组中约 22.5% 的个体即携带新等位基因或结构变异。溶液相靶向杂交捕获结合短读长测序与 KIR 专用判读流程（PING），可在同一体系内解析基因含量、拷贝数与等位基因级别基因型，并在同一反应中捕获 HLA class I，从源头满足联合检测的需要（Norman 等，2016；Marin 等，2021）。
在监管层面，KIR/HLA 分型并非法规强制的放行属性，而是供者选择与起始物料/主细胞库免疫遗传学背景表征的科学输入。本服务可在 FDA《Considerations for the Development of CAR T Cell Products》（2024）、ICH Q5D（细胞基质的来源与表征）、ICH Q2(R2)（分析方法验证）以及中国 NMPA《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》（2017）与 CDE《免疫细胞治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022）的框架下，作为供者与起始物料遗传背景表征的支持性证据；方法可按研究阶段以 fit-for-purpose 确认或依 ICH Q2(R2) 完整验证。
2. 技术原理
本服务以溶液相靶向杂交捕获同时富集 13 个 KIR 基因与 HLA class I 为核心，经 Illumina 短读长双端测序，配合 KIR 专用生信流程 PING，在同一反应内给出 KIR 基因含量、拷贝数与等位基因级别基因型，并同步完成 HLA-A/B/C 分型。核心步骤如下：
(1) 样本接收与质检
接收基因组 DNA 或供者来源细胞，评估浓度、纯度与完整性，确认满足建库与捕获要求。
(2) 文库制备与杂交捕获
将基因组 DNA 打断建库并加双端 index，以生物素化探针（覆盖 13 个 KIR 基因与 HLA-A/B/C）在溶液中杂交，经链霉亲和素磁珠分离非目标 DNA、两轮富集后得到目标文库。
(3) Illumina 短读长测序
进行双端测序、按目标覆盖深度产出数据；参考条件为 MiSeq v3 2×300 bp，读长与平台可在方法学验证支持下调整。
(4) PING 生信分析与判读
以单拷贝框架基因 KIR3DL3 为归一化标尺，由唯一比对读数的相对比值聚类确定基因含量与拷贝数（PING_gc）；据此构建基因型匹配参考、多轮比对输出等位基因级别基因型（GL string）并拼装着丝粒/端粒单体型（PING_allele）；同批数据完成 HLA class I 分型，并给出 KIR–HLA 配体配对与 B 含量评分。
图1. 液相杂交捕获 + PING 的 KIR/HLA 分型技术流程图
3. 技术特色与优势
KIR 与 HLA 同反应同测：一套捕获同时获得 13 个 KIR 基因与 HLA-A/B/C，天然满足“KIR 必须连 HLA”的解读前提，避免多平台数据拼接的口径差异。
三层分辨率一体化：基因含量 → 拷贝数（CNV）→ 等位基因级别 + 着丝粒/端粒单体型，一次数据集内全部给出。
覆盖结构变异：探针针对完整 KIR 单体型设计，可识别缺失、重复与融合等结构变异，相较仅依赖比对的方法更稳健。
高保真、可规模化：短读长高碱基准确度，单批可并行大量样本，适合群体/队列研究与多批次表征筛查。
标准化输出：以 GL string 标准格式报告 KIR/HLA 基因型，便于跨实验室比对与申报数据包对齐。
4. 应用场景
异体/现货型 CAR-NK：供者与起始物料的 KIR/HLA 免疫遗传学背景表征。
移植供者选择：在 HLA 配型基础上加测 KIR，评估 B 含量评分与 KIR-配体错配方向（关联性、具疾病特异性的证据）。
起始物料 / 主细胞库（MCB）表征：供者来源细胞的遗传背景建档与放行支持。
群体与队列研究：大样本 KIR/HLA 基因型与疾病或疗效的关联研究。
IND/BLA 表征：为细胞治疗产品的供者选择与免疫遗传学表征提供支持性证据。
5. 报告与交付内容
报告给出可量化、带基因型、可比较的免疫遗传学证据，核心内容包括：
KIR 基因含量：13 个 KIR 基因的存在/缺失判定。
拷贝数（CNV）：以 KIR3DL3 归一化得到的各 KIR 基因拷贝数。
等位基因级别基因型：GL string 格式，含新等位基因或新 SNP 组合提示。
单体型构成：着丝粒/端粒（Cen/Tel）单体型与 A/B 单体型构成。
B 含量评分：由 Cen-B 与 Tel-B 基序数计算（取值 0–4）。
KIR–HLA 配体配对：HLA-C 的 C1/C2、HLA-Bw4、HLA-A3/A11 等配体表位归属与错配方向。
HLA class I 分型：同批捕获获得的 HLA-A/B/C 等位基因型。
数据交付：完整分析报告（PDF）、KIR/HLA 基因型列表（GL string）、变异与比对文件及原始测序数据。
图2. KIR 基因含量、拷贝数、等位基因型与 KIR–HLA 配体结果示意图
6. 服务流程
服务环节 | 服务内容 |
项目咨询与方案设计 | 依研究阶段与监管目标确定分辨率层级（基因含量/拷贝数/等位基因级）与是否同测 HLA class I，制定方案 |
样本接收与质检 | 评估基因组 DNA 或细胞样本的浓度、纯度与完整性 |
文库制备与杂交捕获 | 制备短读文库，以 KIR + HLA class I 探针 panel 溶液富集目标区域 |
Illumina 短读长测序 | 按目标覆盖深度产出双端高准确度测序数据 |
PING 生信分析 | 基因含量、拷贝数、等位基因级基因型（GL string）、Cen/Tel 单体型、B 含量与 KIR–HLA 配体 |
HLA class I 分型 | 同批数据完成 HLA-A/B/C 分型（按需） |
报告交付与技术支持 | 提供完整分析报告（PDF）、基因型列表与原始数据，并提供后续技术咨询 |
*服务周期：标准流程约 20–30 个工作日；批量样本与加测项目以最终方案为准。
7. 样本要求
项目 | 送样要求 |
样本类型 | 基因组 DNA（推荐）或供者来源细胞沉淀（外周血单个核细胞/单采细胞/主细胞库样本） |
推荐起始量 | gDNA ≥ 300 ng（推荐 ≥ 1 µg，按最低起始量留足余量）；细胞 ≥ 1×10⁶ |
浓度与纯度 | gDNA 建议 ≥ 10 ng/µL；OD260/280 ≈ 1.7–2.0，高分子量、无明显降解 |
配套信息 | 如需 HLA class I 联检请注明；供者/批次信息如可提供，有助于结果建档 |
保存与运输 | 细胞：液氮或干冰冷链；gDNA：–20℃ 冻存，干冰运输 |
*具体送样要求以最新《送样指南》为准；本服务不适用于已严重降解的样本。送样前请预约并确认方案。
8. 技术参数
参数项 | 说明 |
测序平台 | Illumina（MiSeq / NextSeq / NovaSeq；参考条件 MiSeq v3 2×300 bp） |
富集策略 | 溶液相靶向杂交捕获（覆盖 13 个 KIR 基因 + HLA-A/B/C，固定 panel，本服务内含） |
覆盖基因 | KIR 13 基因（KIR2DL1/2/3/4/5、KIR3DL1/2/3、KIR2DS1–5、KIR3DP1）+ HLA-A/B/C |
分辨率 | 基因含量、拷贝数（CNV）、等位基因级别 + 着丝粒/端粒单体型 |
参考库 / 流程 | IPD-KIR、IPD-HLA（对应 release）；PING 判读流程 |
检出能力 | 基因含量、拷贝数、等位基因型（GL string）、B 含量评分、KIR–HLA 配体配对 |
一致性 | 与 PCR-SSP/SSO 等参比方法的基因含量一致性高（文献 >99%）；等位基因级以验证为准 |
方法局限 | 高同源基因（KIR2DL5A/B、KIR2DS1/2DL1、KIR3DL1/3DS1、KIR2DL2/2DL3）与 KIR3DP1 的相位/分辨受短读长限制，必要时以三代测序补足 |
方法状态 | IND：方法确认（fit-for-purpose）；BLA：依 ICH Q2(R2) 完整验证 |
支持物种 | 人源 |
9. 参考文献
[1] Norman PJ, et al. Defining KIR and HLA Class I Genotypes at Highest Resolution via High-Throughput Sequencing. Am J Hum Genet. 2016;99(2):375–391. doi:10.1016/j.ajhg.2016.06.023
[2] Marin WM, et al. High-throughput Interpretation of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Short-read Sequencing Data with PING. PLoS Comput Biol. 2021;17(8):e1008904. doi:10.1371/journal.pcbi.1008904
[3] Cooley S, Weisdorf DJ, Guethlein LA, et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 2010;116(14):2411–2419. doi:10.1182/blood-2010-05-283051
[4] Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science. 2002;295(5562):2097–2100. doi:10.1126/science.1068440
[5] Liu E, Marin D, Banerjee P, et al. Use of CAR-Transduced Natural Killer Cells in CD19-Positive Lymphoid Tumors. N Engl J Med. 2020;382(6):545–553. doi:10.1056/NEJMoa1910607
[6] Milius RP, Mack SJ, Hollenbach JA, et al. Genotype List String: a grammar for describing HLA and KIR genotyping results in a text string. Tissue Antigens. 2013;82(2):106–112.
[7] ICH. Q2(R2): Validation of Analytical Procedures. Step 4 version, 2023.
[8] Robinson J, Halliwell JA, Hayhurst JD, et al. The IPD and IMGT/HLA database (IPD-KIR / IPD-HLA). Nucleic Acids Res. 2015;43:D423–D431.
