通用型CAR-T安全性评估全流程解决方案

通用型CAR-T安全性评估全流程解决方案

1、行业背景与监管要求

通用型CAR-T（Allogeneic CAR-T, UCAR-T）细胞疗法通过基因编辑技术敲除T细胞内源性的TCR（T Cell Receptor）及HLA（Human Leukocyte Antigen）等基因，旨在开发可供“现货”（off-the-shelf）使用的异体细胞治疗产品，已成为细胞与基因治疗（CGT）领域最具潜力的发展方向之一。然而，基因编辑技术的引入在实现治疗突破的同时，也带来了新的安全性挑战。

全球范围内的监管机构，包括美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）下属的药品审评中心（CDE），均对基因编辑产品的安全性，特别是脱靶效应、染色体结构变异、载体整合风险以及编辑工具残留等问题，提出了全面而严格的评估要求 。

FDA 在《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》[1]（2024）中明确要求基因编辑产品进行全面的脱靶风险评估，强调应采用多种方法进行基因组范围的分析以减少潜在脱靶位点识别中的偏差。我们采用多层次、多维度的综合检测策略，使用多个来源的供者样本以及设置科学的实验分组进行检测，该策略能够为基因编辑产品的临床前安全性评估提供充分的科学依据，确保IND申报材料符合监管要求并支持临床试验的顺利开展。

2、行业痛点分析

在UCAR-T产品的研发与IND申报过程中，企业普遍面临以下挑战：

3、全流程安全性评估解决方案

为应对上述挑战，舒桐科技整合了最前沿的基因组学检测技术与生物信息学分析能力，构建了一套覆盖UCAR-T产品从“靶点设计”到“IND申报”全流程的基因编辑安全性评估解决方案。该方案以模块化的方式提供服务，确保评估的系统性、专业性与合规性。

3.1 整体技术路线图

我们的技术路线遵循“分阶段、多维度”的原则，从源头优化编辑工具，到最终全面的安全性验证，层层递进，确保数据的可靠性与完整性。

图1. 通用型CAR-T细胞基因编辑安全性评估技术路线图：本图展示了基因编辑产品从早期筛选到IND申报的完整安全性评估流程，包括三个主要阶段：Phase 1通过生物信息学预测、GUIDE-seq Pool检测、流式筛选验证编辑效率以及扩增子测序，筛选出高编辑效率、低脱靶频率的sgRNA；Phase 2采用多维度策略进行IND申报级安全性评估，包括脱靶效应分析（CRISPRme预测、GUIDE-seq、AID-seq及高频脱靶位点验证）、染色体结构稳定性评估（核型分析、PEM-seq、Long-range PCR）、载体整合检测（LM-PCR用于慢病毒/转座子，液相杂交捕获用于AAV）以及编辑工具残留检测（RT-qPCR和ELISA）；Phase 3整合所有数据形成综合安全性档案，支持IND提交。

3.2 核心服务模块详解

模块一：sgRNA靶点优化与筛选平台

此阶段的核心目标是系统性地筛选出兼具高在靶编辑效率和低脱靶风险的优质sgRNA，为后续的IND申报级安全性评估奠定坚实基础。整个流程通过计算设计、实验筛选和验证，确保最终选出的sgRNA在安全性和有效性上达到最优平衡。

（1）设计候选sgRNA：流程始于生物信息学软件设计。我们利用先进的算法和全面的基因组数据库，针对目标基因设计一系列候选sgRNA。这些预测工具不仅评估每个sgRNA的在靶活性（On-target Score），还全面预测其在全基因组范围内的潜在脱靶位点，从而进行初步的优先级排序。

（2）GUIDE-seq Pool检测：将设计出的多个候选sgRNA在单个电转实验完成后合成为一个DNA Pool，并应用于GUIDE-seq建库。GUIDE-seq是一种无偏倚的全基因组脱靶检测技术，通过在细胞中标记并测序由CRISPR-Cas9系统引起的DNA双链断裂位点，能够快速、有效地绘制出整个sgRNA库的脱靶活性图谱，实现对候选sgRNA的初步脱靶风险筛选。

（3）流式细胞术筛选编辑效率：为了评估在靶编辑效率，我们利用流式细胞术进行高通量筛选。通过构建报告系统（例如，与基因编辑事件偶联的荧光蛋白表达），可以对单个细胞的编辑状态进行定量分析，从而精确评估每个候选sgRNA的在靶活性，并富集具有高编辑效率的细胞群体。

（4）扩增子测序验证脱靶效率：综合GUIDE-seq的结果，挑选出候选sgRNA的脱靶位点进行深度验证。通过对潜在的脱靶位点进行靶向扩增子深度测序（Amplicon Sequencing），可以精确定量每个位点的Indel（插入/缺失）频率，从而获得准确的脱靶效率数据，计算该条sgRNA在单编辑样本中的累积脱靶频率。

质量控制（QC）

• 样本累积脱靶突变频率 ≤ 10%

• 单个位点脱靶突变频率 ≤ 5%

只有同时满足高在靶编辑效率和低脱靶频率（符合上述QC标准）的sgRNA，才会被最终确定为高保真sgRNA（High-fidelity sgRNA），进入后续的IND申报级安全性评估阶段。

模块二：基因编辑工具与递送系统

此模块为客户提供多样化的编辑工具和递送方案选择，以匹配不同的细胞类型和研发阶段需求。

模块三：编辑有效性验证

在进行全面的安全性评估之前，必须确认基因编辑操作在目标位点上是成功的。我们提供多层次的验证服务：

模块四：脱靶效应全面分析（IND核心数据包）

此模块是IND申报的核心，采用多种互补的技术手段，构建完整的脱靶评估证据链。

策略核心：遵循FDA指南建议，不依赖任何单一方法，而是采用“体内脱靶检测（Cellular-based）+ 体外脱靶检测（Biochemical）+ 软件预测（In Silico）”正交互补的策略进行全面检测。

（1）软件预测与风险评估 (In Silico Prediction）：CRISPRme 预测工具包含了大规模人群基因组数据中的单核苷酸多态性（SNP）信息，能够预测因个体遗传差异而可能产生的、在参考基因组上不存在的脱靶位点。这一步骤为后续的实验设计提供了全面的候选位点列表，并对不同位点的潜在风险进行了初步评级。

（2）细胞水平脱靶检测 (GUIDE-seq）：GUIDE-seq是业内公认的细胞内脱靶检测“金标准”。GUIDE-seq是一种高效的全基因组脱靶检测方法，其基本原理是利用短双链寡核苷酸标签（dsODN tag）来标记CRISPR-Cas诱导的断裂位点（在靶和脱靶），然后对标签所在的基因组区域进行高通量测序，最终通过生物信息学分析确定脱靶位点在基因组上的具体位置信息及功能注释。若为多靶点编辑，需要同时提供单靶点和多靶点的编辑样本比较数据，证明多靶点脱靶检测敏感性和准确性。

（3）体外水平脱靶检测 (AID-seq）：AID-seq是一种在体外环境中进行的高灵敏度脱靶检测方法。与GUIDE-seq在活细胞内检测不同，AID-seq 使用纯化的野生型基因组DNA和Cas9 RNP复合物在体外进行切割反应。由于摆脱了细胞内染色质结构、DNA 甲基化等复杂因素的干扰，Cas9 能够更自由地接触基因组DNA从而暴露出所有的DSB，以更高的灵敏度检测出潜在的脱靶位点。

（4）液相杂交捕获脱靶验证：液相杂交捕获测序是潜在脱靶位点的验证步骤，也是提供定量数据的关键环节。该技术的核心原理是序列特异性杂交：将定制化的探针库与基因组 DNA 文库在液相中进行杂交反应，探针会根据碱基互补配对原则，特异性地结合到目标区域的 DNA 片段上。由于探针上标记有生物素，我们可以使用链霉亲和素磁珠将结合了探针的 DNA片段从文库中“捕获”出来，从而实现对目标区域的高效富集。

模块五：染色体结构稳定性评估

基因编辑除了导致缺失、插入、替换以外，还可能导致染色体大片段的结构变异，这是必须严格评估的重大安全风险。

（1）PEM-seq (Primer-Extension-Mediated-sequencing）：PEM-seq作为一种高灵敏度的染色体重排易位检测方法，能够检测到传统FISH技术可能遗漏的微小重排事件；传统FISH检测通常需要预先知道可能的重排位点，而PEM-seq采用全基因组方法，能够无偏向性地检测所有潜在的染色体重排事件，结合高通量测序技术，能够提供单碱基水平的精确定位，远超FISH的分辨率限制。因此，PEM-seq作为申报成功案例里均使用的方法，得到官方认可并且具有更完善的生物信息学分析工具和标准化流程。

（2）Long-Range PCR结合二代测序：Long-range PCR是一种专门针对基因编辑后大片段删除变异事件的高灵敏度检测方法。其核心原理是通过在目标切割位点（cut-site）上下游约5kb处设计特异性引物，扩增跨越切割位点的长片段DNA（约10kb），从而有效捕获包括大片段缺失、插入等多个复杂结构变异事件，补充了PEM-seq技术由于读长限制以及引物结合区域的检测限制，弥补了在大片段缺失检测方面的局限性，为基因治疗产品的安全性评估提供全面可靠的数据支持。

（3）核型分析 (Karyotyping）：作为经典方法，用于检测染色体数目异常和宏观结构变化，是安全性评估的基础组成部分。核型分析通过显微镜观察细胞分裂中期染色体的形态、数目和结构来检测染色体异常。其基本原理是利用细胞在有丝分裂中期时染色体高度螺旋化和浓缩的特点，此时染色体形态清晰可见，易于观察和计数。通过特定的染色技术（如G显带、Q显带等），可以显示每条染色体的特征性条带模式，从而识别每条染色体并检测其结构异常。该方法能够检测染色体数目异常（如三体、单体）、大片段的结构异常（如易位、倒位、缺失、重复等）以及标记染色体等各种染色体畸变。

模块六：载体整合位点分析

通用型 CAR-T 细胞的制备通常需要通过基因工程手段将CAR基因导入T细胞，这一过程中使用的载体系统可能会整合到宿主基因组中。载体整合位点的检测和分析是评估产品安全性的关键环节，因为随机整合可能导致插入突变、激活原癌基因或破坏抑癌基因，从而增加基因毒性风险。不同的载体系统（转座子、慢病毒、AAV）具有不同的整合特性和风险特征，因此需要采用针对性的检测策略。

本模块针对三种主要的基因递送载体系统，提供全面的整合位点检测和安全性评估服务。转座子载体（如 Sleeping Beauty、piggyBac）和慢病毒载体由于具有主动整合的特性，整合频率较高，需要通过ITR/LTR特异性PCR结合高通量测序，全面鉴定所有整合位点并进行克隆追踪。AAV载体虽然主要以核外体形式存在，但仍存在罕见的整合事件（<0.01%），需要通过高深度的液相杂交捕获测序来检测这些低频整合。

模块七：编辑工具残留检测

评估最终细胞产品中编辑工具（sgRNA、Cas9蛋白/mRNA）的残留水平，是产品放行（Lot Release）的关键质控项目。

（1）sgRNA残留检测：采用优化的RT-qPCR方法，通过特异性逆转录引物和高灵敏度的荧光定量PCR，可实现pg级别的精确定量。

（2）Cas9蛋白残留检测：采用高特异性的双抗体夹心ELISA方法，可实现ng/mL级别的蛋白残留定量。

4、服务模式

5、客户价值

一站式服务，缩短40-50%项目周期，统一数据标准，简化项目管理。

6、我们的优势

• 全链条技术覆盖：国内少数同时具备“靶点筛选、编辑工具、递送载体、有效性验证、安全性评估”全流程服务能力的企业，极大降低客户的管理和沟通成本。

• 丰富的CGT行业经验：已成功服务多家头部CGT企业，深度理解IND申报的监管要求和技术难点，能提供专业的合规性建议。

• 灵活的服务模式：支持整体打包与单项服务，可根据客户的具体需求和预算提供定制化方案。

7、参考文献

1.《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》2024;

2.《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》2022；

3.《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则 （试行）》2021；

4.Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, Liebers M, Topkar VV, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 2015;33(2):187-197.

5.Lazzarotto C R , Malinin N L , Li Y ,et   al. CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR–Cas9 genome-wide activity[J].Nature Biotechnology, 2020, 38(11):1-11.DOI:10.1038/s41587-020-0555-7.

6. 国际人用药品注册技术协调会。 (2005). ICH三方协调指导原则：分析方法论证：正文和方法学 Q2(R1) [现行第4阶段版本].

7. 美国食品药品监督管理局。 （2018年5月）。 生物分析方法验证：行业指南。 美国卫生与公共服务部食品药品监督管理局药品评价和研究中心与兽医药品中心。