三代PEM-seq同源重组效率检测

三代PEM-seq同源重组效率检测

1. 背景介绍

基因编辑技术在基因治疗、疾病模型构建和功能基因组学研究中发挥着重要作用。其中，基于同源重组（Homologous Recombination, HR）的同源臂介导的基因敲入策略是实现精准基因编辑的重要手段。该策略通过设计包含同源臂序列的供体模板（Donor），在CRISPR等基因编辑工具产生双链断裂（DSB）后，利用细胞自身的同源重组修复机制将目的基因精准整合到靶位点。

然而，同源臂介导的基因整合通常涉及较长的DNA序列插入（通常为数百bp至数kb），这对检测技术提出了严峻挑战。传统的基于PE150测序的二代PEM-seq检测方法，受限于双端150bp的读长限制，无法跨越长片段插入区域，难以准确检测整合事件和评估整合效率。此外，对于涉及同源臂整合的基因编辑项目，还需要明确区分成功整合、部分整合、随机插入等不同修复结果，这要求检测方法必须具备长读长和高准确性。

针对这一技术瓶颈，舒桐科技推出了基于PacBio三代测序平台的三代PEM-seq插入整合检测技术。该技术突破了二代测序的读长限制，可实现对长片段DNA插入的全长覆盖，精准检测同源臂整合事件，全面评估基因编辑的整合效率和准确性，为基因治疗产品的研发和临床转化提供关键的质量控制手段。

图1 同源重组介导的基因整合策略及二代测序技术局限

2. 三代PEM-seq检测原理

三代PEM-seq技术是在二代PEM-seq基础上发展的升级版本，核心原理仍是通过在DSB位点附近设计特异性引物（诱饵primer），捕获与DSB位点连接的序列（猎物序列），但采用PacBio三代测序平台进行长读长测序，从而实现对长片段插入的完整检测。

该技术主要包括以下关键步骤：

（1）样本DNA制备与片段化处理，引入分子标签体系以减少PCR偏差并实现精准定量，随后通过生物素标记的特异性引物进行靶向富集，扩增覆盖目标基因组序列、同源臂序列及部分插入序列的区域。

（2）富集产物经磁珠筛选纯化后，构建测序文库并上机进行PacBio HiFi测序，获得长读长、高准确度的测序数据，实现对插入片段的全长覆盖和精准分析。

3. 三代PEM-seq检测与分析优势

基于PacBio长读长测序平台，三代PEM-seq技术通过精准检测基因组-同源臂和同源臂-插入序列两个关键junction区域，验证整合准确性；同时全面识别正确整合、反向整合、多拷贝串联、截短插入等多种整合模式，为基因编辑安全性评估提供关键数据支持。

图2 三代PEM-seq精准Junction检测与整合模式全面分析

3.1 长读长检测

PacBio测序平台可提供长读长测序能力，完整覆盖扩增产物序列长度（主要为2-3kb），精准识别关键junction区域：

（1）基因组-同源臂junction：验证同源臂正确整合；

（2）同源臂-插入序列junction：确认插入序列连接准确性；

（3）整合结构完整性：检测同源臂及部分插入序列的完整性；

（4）复杂整合模式：识别反向插入、多拷贝串联等复杂结构。

3.2 高准确度定量分析

借助UMI分子标签技术，三代PEM-seq可实现对不同整合事件的精准定量：

（1）整合效率评估：准确计算成功整合事件占总编辑事件的比例；

（2）整合事件定量分析：基于junction序列特征，准确计算插入事件发生率；对于同一靶点的不同整合事件，可通过扩增区域内的序列差异进行区分和分类统计；

（3）背景噪音控制：通过对照组比对，有效排除背景干扰。

3.3 全面的结构变异检测

在检测插入整合的同时，三代PEM-seq仍保留二代PEM-seq的检测能力：

（1）小片段插入缺失（Indel）；

（2）大片段缺失（Large Deletion）；

（3）染色体易位（Translocation）；

（4）染色体倒位（Inversion）；

（5）脱靶效应评估。

3.4 高质量数据输出

（1）测序准确性：PacBio HiFi模式准确率可达99.9%，媲美二代测序；

（2）覆盖深度：单个靶点可获得数千至数万条有效reads；

（3）数据可靠性：通过UMI去重和多重质控，确保数据真实可靠。

4. 三代PEM-seq检测应用场景

4.1 AAV/慢病毒介导的基因治疗

（1）HDR介导的基因矫正；

（2）治疗性基因定点整合；

（3）Safe harbor位点基因敲入；

（4）整合效率和安全性评估。

4.2 CAR-T/CAR-NK细胞治疗

（1）CAR基因定点整合；

（2）TCR基因敲除结合CAR基因敲入；

（3）多基因同时编辑整合检测。

4.3 疾病模型构建

（1）疾病相关基因定点整合；

（2）报告基因敲入；

（3）条件性基因敲入验证。

4.4 功能基因组学研究

（1）标签蛋白融合表达；

（2）基因过表达/敲入验证；

（3）CRISPR文库筛选后整合验证。

4.5 IND申报支持

（1）基因治疗产品整合效率检测；

（2）整合位点准确性验证；

（3）非预期整合事件评估；

（4）质量控制关键指标建立。

5. 三代PEM-seq检测示例报告

舒桐科技提供详实、专业的插入整合分析报告，完全符合基因治疗产品IND申报要求。报告核心内容包括：

（1）样本信息与测序质量评估：报告首页包含完整的样本追溯信息(项目编号、委托单位、样本信息、日期等)和测序质量参数(测序平台、数据产出量、覆盖深度、Q30等)。采用UMI分子标签技术进行PCR去重，确保定量结果准确可靠。

（2）Junction序列精准解析与整合效率评估：基于PacBio长读长测序(2-5kb)完整覆盖基因组-同源臂junction和同源臂-插入序列junction区域，精准验证同源臂整合的准确性和插入序列连接的完整性。提供junction区域详细序列信息、reads支持数据，并准确计算插入事件发生率。对同一靶点的不同整合事件，通过扩增区域内的序列差异进行区分和分类统计。

（3）复杂整合模式与结构变异全面检测：识别并定量分析多种整合模式(正向/反向整合、单拷贝/多拷贝串联、完整/截短插入等)；全面检测CRISPR编辑可能引发的大片段缺失(>1kb)、染色体易位、倒位等结构变异事件，评估基因组完整性和产品安全性。

（4）数据可视化与质控信息：提供IGV基因组浏览器可视化图谱、整合事件统计表、结构变异检测结果等；报告包含完整的检测方法学说明、质量控制参数和数据解读，满足监管申报要求。

如需查看完整示例报告，请联系我们获取。

6. 三代PEM-seq检测服务内容

*服务周期：标准流程35-40个工作日；

*服务特色：

（1）可提供从Donor设计、sgRNA设计到结果分析的一体化服务；

（2）支持单靶点、双靶点及多靶点检测；

（3）可提供定制化分析方案。

7. 样本要求

7.1 基础服务选项

（1）一体化服务：可提供Donor质粒构建、细胞转染、DNA提取到测序分析的全流程服务（客户需提供细胞系）；

（2）建库测序服务：客户提供合格DNA样本，舒桐提供建库、测序及分析服务；

（3）仅测序分析服务：客户提供建库产物，舒桐提供测序及分析服务。

7.2 DNA样本标准

7.3 细胞样本标准

7.4 实验分组要求

强烈建议同时提供实验组（基因编辑后）和对照组（未编辑）样本，用于准确评估整合效率和排除背景干扰。

7.5 客户需提供的信息

强烈建议同时提供实验组（基因编辑后）和对照组（未编辑）样本，用于准确评估整合效率和排除背景干扰。

（1）样本类型及名称

（2）基因编辑靶点信息（基因名称、染色体位置）

（3）sgRNA序列（含PAM序列）

（4）Cut-site坐标（hg38或其他参考基因组版本）

（5）Donor序列信息（完整序列，标注同源臂、插入序列等关键区域）

（6）预期整合方式说明（单拷贝/多拷贝，定向/非定向等）

（7） 编辑类型（单靶点/双靶点/多靶点）

7.6 增值服务

（1）Donor质粒设计与构建：根据整合策略设计最优同源臂和插入序列

（2）sgRNA设计与验证：提供高效低脱靶的sgRNA序列

（3）个性化分析：根据项目特点定制分析内容

（4）监管申报技术支持：提供IND申报所需的技术文件和数据支持

7.7 注意事项

（1）所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性

（2）对于特殊样本类型或非常规需求，请提前与舒桐技术团队沟通

（3）联系方式：15336557985；技术支持邮箱：service@generulor.com

8. 参考文献

[1] Liu, M., et al. (2021). Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR–Cas9. Nucleic Acids Research, 49(15), 8732-8742.

[2] Liu, Y., et al. (2022). PEM-seq comprehensively quantifies DNA repair outcomes during gene-editing and DSB repair. STAR Protocols, 3(1), 101088.

[3] Yin, J., et al. (2019). Optimizing genome editing strategy by primer-extension-mediated sequencing. Cell Discovery, 5, 18.

[4] FDA. Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing - Guidance for Industry. 2024.

[5] FDA. Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products - Guidance for Industry. 2020.

[6] 国家药监局药审中心. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则(试行). 2022.