单细胞蛋白组测序

单细胞蛋白组测序

1. 背景介绍

CRISPR-Cas9基因编辑技术已成为细胞治疗领域的核心工具，尤其在CAR-T、TCR-T等工程化免疫细胞治疗中发挥着关键作用。通过敲除内源性T细胞受体（TCR）基因可消除移植物抗宿主病风险，敲除免疫检查点基因（如PD-1）可增强抗肿瘤活性。2020年发表的CRISPR-CAR临床试验首次证明了同时编辑TCRA、TCRB和PDCD1三个基因的可行性，标志着多靶点基因编辑细胞疗法进入临床应用阶段[1]。

然而，基因编辑产品的安全性和有效性评价面临新的技术挑战。传统的群体水平检测方法无法回答以下关键问题：目标基因的敲除是否在蛋白水平得到功能性验证？不同编辑结果（移码突变vs非移码突变）对蛋白表达的影响是否一致？在多靶点编辑场景下，同时实现多个基因功能性敲除的细胞比例是多少？这些问题的解答需要将基因型（genotype）和表型（phenotype）信息在单细胞水平进行整合分析[2,3]。

针对这一技术需求，舒桐科技引进并优化了基于Tapestri平台的单细胞DNA+蛋白多组学检测技术。该技术能够在同一个细胞中同时检测基因编辑状态和相应的蛋白表达水平，实现基因型-表型的直接关联分析，为CRISPR基因编辑产品提供从DNA到蛋白的全链条质量评价体系[4,5]。

2. 单细胞DNA+蛋白多组学检测原理

单细胞DNA+蛋白多组学检测技术的核心是在单细胞DNA测序的基础上，通过抗体-寡核苷酸偶联物（Antibody-Oligo Conjugates, AOC）技术实现对细胞表面蛋白的定量检测。每个AOC由特异性抗体和带有独特条码序列的寡核苷酸组成，抗体结合目标蛋白后，条码寡核苷酸与基因组DNA一同被扩增和测序，从而实现同一细胞的基因型和蛋白表型的联合检测。

检测流程包括：首先使用包含目标蛋白抗体的AOC panel对待检测细胞进行染色标记；随后将染色后的细胞与裂解缓冲液共同封装于微液滴中进行细胞裂解，释放基因组DNA和结合在细胞表面的AOC；在条码标记液滴中，通过多重PCR同时扩增目标基因组区域和蛋白条码序列；扩增产物经过文库构建和高通量测序后，通过Tapestri GE分析流程结合DAb-seq蛋白分析流程进行数据解析，最终实现单细胞分辨率的基因编辑状态与蛋白表达水平的整合分析。

图1 单细胞DNA+蛋白多组学检测CRISPR基因编辑流程示意图（流程图中的基因和蛋白标记可根据实际实验设计调整，此处仅为示例）

3. 单细胞DNA+蛋白多组学技术创新与优势

3.1 核心技术创新

3.1.1 基因型-表型联合分析

突破传统分析方法局限，实现基因编辑结果与蛋白表达的直接关联：

（1）在同一细胞中同时获取DNA编辑状态和蛋白表达信息；

（2）验证基因敲除是否在蛋白水平实现功能性沉默；

（3）解析不同类型编辑（移码/非移码）对蛋白表达的差异影响。

3.1.2 多靶点功能性敲除评估

精确定义目标细胞群体，评估产品功能性质量：

（1）同时检测多个靶点的编辑状态和对应蛋白表达；

（2）精确量化同时实现多基因功能性敲除的细胞比例；

（3）区分“基因编辑”与“功能性敲除”，避免高估编辑产品效力。

3.1.3 细胞免疫表型分析

支持多重蛋白标志物检测，实现细胞亚群精细分型：

（1）45重AOC panel覆盖主要免疫细胞表面标志物（表1）；

（2）支持CD4+/CD8+ T细胞、NK细胞等亚群分型；

（3）结合编辑信息评估不同细胞亚群的编辑效率差异。

表1 Mission Bio（Tapestri）Heme Oncology Protein Panel（45-plex；42个表面标志物 + 3个同型对照）

3.1.4 编辑动力学监测

支持多时间点纵向分析，揭示编辑与蛋白变化的时序关系：

（1）追踪编辑后不同时间点的基因型和蛋白型变化；

（2）评估蛋白敲除达到稳态的时间窗口；

（3）监测易位细胞的适应性变化趋势。

3.2 方法学验证与性能指标

舒桐科技采用TCRA-TCRB-PDCD1三靶点编辑的原代T细胞进行了全面系统验证，结合同基因克隆细胞系验证数据，证实了单细胞DNA+蛋白多组学平台的检测性能：

4. 应用场景与服务优势

4.1 应用场景

单细胞DNA+蛋白多组学技术在CRISPR基因编辑细胞产品研发与监管过程中的应用场景广泛：

（1）CAR-T/TCR-T产品功能性质量控制：验证TCR、PD-1等靶点在蛋白水平的功能性敲除效率；

（2）多靶点编辑产品效力评估：精确定义同时实现多基因功能性敲除的“目标细胞”比例；

（3）编辑策略优化：比较不同gRNA设计、编辑条件对功能性敲除效率的影响；

（4）基因编辑产品IND申报支持：提供基因型-表型整合分析的监管级数据包；

（5）临床样本全链条质量监测：支持从基因编辑到蛋白功能的完整质量评估体系；

（6）细胞亚群分型与编辑差异分析：评估CD4+/CD8+ T细胞等亚群的编辑特征差异。

4.2 服务优势

（1）技术领先：国内首家提供单细胞DNA+蛋白多组学CRISPR编辑分析的专业服务商；

（2）全链条评估：从基因编辑到蛋白功能的完整质量评价体系，确保产品效力评估的准确性；

（3）认证质量管理：实验室同时运行ISO9001与CNAS质量管理体系；

（4）专业分析流程：基于scEDIT和DAb-seq的整合分析流程，提供全面的多组学数据解析；

（5）丰富成功案例：已帮助多家领先企业完成工程化免疫细胞产品的功能性质量评价。

5. 单细胞DNA+蛋白多组学检测示例报告

舒桐科技提供符合监管要求的全面单细胞DNA+蛋白多组学CRISPR编辑分析报告，包含DNA和蛋白测序数据质量评估、细胞捕获统计等基础信息。图2是生信分析流程。

本流程图系统展示了单细胞 CRISPR 基因编辑安全性评估的整体分析路径。围绕拟编辑的目标基因，基于序列特征、算法模型及文献报道对潜在脱靶位点进行 in silico 预测，并筛选高概率脱靶位点纳入检测范围。在此基础上，设计同时覆盖在靶与脱靶位点的定制化扩增子 panel，完成单细胞测序建库与数据获取。测序数据获得后，开展多层次生物信息学分析：通过 scEDIT 解析单细胞编辑状态，定量评估在靶与脱靶位点的编辑效率、等位基因状态及多靶点编辑共发生情况，并结合可视化分析展示不同编辑状态细胞群体的分布特征；同时，基于 scEDIT 产生的中间reads文件，构建定制化分析流程，对潜在染色体易位事件进行检测与统计，重点评估在靶与脱靶之间的结构变异风险。在此基础上，综合脱靶位点的编辑效率及相关基因的功能危险性，对脱靶事件进行风险分级，并整合形成综合性的单细胞基因编辑安全性评估报告，为基因编辑产品的风险评估与决策提供依据。此外，可结合单细胞蛋白数据开展表面标志物定量分析：基于 AOC/抗体标签对每个细胞的蛋白表达进行profiling，并与 scEDIT 得到的基因型结果进行关联（genotype–phenotype），用于验证蛋白层面的敲除/表达变化及其与编辑效率的相关性，从而提升功能层面的安全性评估证据链。

图2 单细胞DNA和蛋白测序检测CRISPR基因编辑数据分析流程示意图

根据客户的真实需求以及实验目的，报告可包含以下核心内容：

（1）基因编辑效率与合子性分析：提供每个目标位点在细胞和等位基因水平的编辑效率统计，区分未编辑、单等位基因编辑和双等位基因编辑的细胞比例，同步展示对应蛋白表达水平的变化趋势。除了常规的单时间点分析之外，也可以做多时间点编辑分析（图3），以达到以下目的：

1. 验证基因型-表型关联 - 确认编辑状态与蛋白表达的对应关系

2. 评估编辑稳定性与细胞动态 - 监测编辑效率峰值、稳定性及细胞适应性

3. 优化治疗产品收获时间 - 确定最佳细胞收获窗口

图3 多时间点编辑效率与蛋白表达动态变化图

（2）基因型-蛋白表型关联分析：展示不同编辑状态（未编辑、单等位基因移码、双等位基因移码、双等位基因非移码）与目标蛋白表达水平的定量关联，验证基因敲除的功能性效果。

图4 基因型-蛋白表型关联小提琴图分析

（3）多靶点功能性敲除评估：精确量化同时实现多基因功能性敲除（定义为双等位基因移码突变且蛋白表达阴性）的细胞比例，评估产品的真实效力。

图5 多靶点功能性敲除细胞比例统计图

（4）Off-target活性与蛋白功能分析：检测脱靶编辑事件在目标功能性敲除细胞群体中的分布，评估携带脱靶编辑的细胞比例对产品安全性的潜在影响。

图6 功能性敲除细胞中的Off-target分布分析

（5）染色体易位与蛋白功能监测：对于编辑效率高但具有潜在风险的易位，可通过蛋白表达数据分析携带易位细胞的免疫表型特征。纵向追踪研究显示，部分易位细胞可能在体内被自然选择淘汰，因此对产品长期安全性的影响相对有限。

图7 易位事件多时间点动态监测图

（6）细胞亚群分型与编辑特征分析：基于蛋白标志物进行细胞亚群分型（如CD4+/CD8+ T细胞），分析各亚群的编辑效率和功能性敲除差异。

图8 细胞亚群编辑特征UMAP聚类分析图

6. 单细胞DNA+蛋白多组学检测服务内容

7. 样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准；②蛋白检测对细胞新鲜度要求较高，建议优先使用新鲜样本；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

8. 参考文献

[1] Stadtmauer EA, et al. (2020). CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science, 367(6481):eaba7365.

[2] ten Hacken E, et al. (2020). High throughput single-cell detection of multiplex CRISPR-edited gene modifications. Genome Biology, 21:266.

[3] Kalter N, et al. (2025). Precise measurement of CRISPR genome editing outcomes through single-cell DNA sequencing. Mol Ther Methods Clin Dev, 33:101449.

[4] Ruff DW, et al. (2022). High-Throughput Multimodal Single-Cell Targeted DNA and Surface Protein Analysis Using the Mission Bio Tapestri Platform. Methods Mol Biol, 2386:171-188.

[5] Moshref M, et al. (2024). Assessing a single-cell multi-omic analytic platform to characterize ex vivo-engineered T-cell therapy products. Front Bioeng Biotechnol, 12:1417070.