ASO/siRNA计算机脱靶预测

ASO/siRNA计算机脱靶预测

1. 背景介绍

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASO）和小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）作为新一代精准核酸药物，通过序列特异性识别靶标RNA，在基因表达层面实现精准调控，已成为罕见病、遗传性疾病、神经退行性疾病及代谢性疾病治疗的重要手段。ASO主要通过RNase H介导的mRNA降解或空间位阻效应发挥作用；siRNA则依赖RNA诱导沉默复合体（RISC）切割靶mRNA，具有更强的靶向特异性。相比传统小分子和抗体药物，核酸药物具有靶点覆盖广、设计周期短、序列可定制等显著优势，能够针对传统药物难以干预的靶点开发治疗方案，已在全球生物医药研发管线中占据重要战略地位。

随着多款ASO及siRNA药物相继在全球获批上市，覆盖脊髓性肌萎缩症、遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、急性肝卟啉症、高胆固醇血症等多个适应症，核酸药物的临床价值与商业可行性已得到充分验证。与此同时，全球核酸药物研发管线持续扩张，大量候选分子进入临床前及临床开发阶段，市场前景广阔，成为当前生物医药领域最具增长潜力的赛道之一。

然而，核酸药物开发的成功率高度依赖于序列的精准设计与全面的安全性评估。ASO/siRNA的安全性风险主要来源于两个维度：其一为序列依赖性（杂交依赖性）脱靶效应——由于核酸序列的高度相似性，药物可能与非目标基因发生非预期杂交结合，引发杂交依赖性脱靶效应（Hybridization-Dependent Off-Target Effects），导致非靶标基因表达异常，是核酸药物临床前毒性信号的重要来源之一；其二为序列非依赖性效应——例如ASO可能引发的补体激活、凝血功能干扰等类效应（class effects），以及siRNA通过TLR7/TLR8等固有免疫受体激活所引发的免疫刺激反应等。近年来，国际ICH、全球主要监管机构（FDA、EMA、PMDA、CDE）及寡核苷酸安全工作组（OSWG）相继出台相关专项技术指导文件，对核酸药物的安全性评估提出明确且系统的要求：

图1 全球核酸药物主要监管文件时间线

计算机脱靶预测作为药物研发早期的关键环节，能够在体外实验前系统性识别潜在脱靶位点，为后续实验验证提供预测参考，显著降低研发成本和时间。FDA于2024年11月发布《寡核苷酸类药物非临床安全性评估指南》（Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics），明确要求在IND申报前，需对候选序列及其代谢产物开展覆盖转录组、核基因组及线粒体基因组的全面杂交依赖性脱靶评估，并结合RNA-seq转录组实验验证与计算机预测进行交叉分析。系统性、规范化的安全性评估，已成为核酸药物能否顺利推进IND申报的核心前提。

图2 FDA寡核苷酸药物序列依赖型脱靶杂交效应评估要求

（该指南明确要求采用in silico结合体外方法（包括RNA-seq）对ONTs潜在脱靶位点进行系统评估）

舒桐科技基于多年安全性评估服务经验，整合前沿生物信息学算法与专业数据库资源，建立了符合监管要求的ASO/siRNA计算机脱靶预测平台，为核酸药物的安全性评估提供科学、全面的数据支撑。

2. 计算机脱靶预测原理

计算机脱靶预测基于Watson-Crick碱基配对原理，通过序列比对算法在全基因组及转录组范围内系统性搜索与目标ASO/siRNA序列高度相似的核酸片段。即使存在少量碱基错配，这种序列相似性仍可能导致非特异性结合，干扰非目标基因的正常功能。

预测流程采用分层评估策略：

（1）全序列扫描：针对完整药物序列（如20bp ASO）及其潜在体内代谢产物（如截断序列），在参考基因组的转录组、核基因组及线粒体基因组中进行全面搜索；

（2）容错匹配分析：根据药物类型设定合理的错配容忍度，系统识别所有符合相似性阈值的潜在结合位点；

（3）风险分级注释：整合组织表达数据、基因功能数据库、疾病关联数据及必需基因信息，对识别的脱靶位点进行多维度安全性评估。

通过上述分析，可全面识别高、中、低风险脱靶位点，为体外实验验证提供预测参考。计算机预测与RNA-seq转录组验证可独立或同步开展，二者交叉分析可提升脱靶评估的全面性。

图3 ASO/siRNA脱靶效应示意图

3. 技术特色与优势

（1）全面评估，覆盖监管要求

严格遵循FDA指南，评估范围覆盖转录组、核基因组及线粒体基因组，同时分析药物完整序列及其潜在体内代谢产物。针对不同药物类型（ASO/siRNA）采用差异化预测策略，确保脱靶风险评估的全面性与准确性。

（2）精准分级，锁定高风险靶点

基于序列同源性分析，结合靶组织表达数据、必需基因数据库及疾病关联数据库，建立三级风险分级体系（高/中/低风险），精准识别需重点关注的脱靶位点，为研发决策提供明确方向。

（3）快速交付，无缝衔接实验

计算机预测周期短（10个工作日），显著降低早期研发成本。预测结果可与RNA-seq转录组验证实验进行交叉对比分析，形成完整的脱靶评估体系，同时支持IND申报的监管数据要求。

图4 脱靶预测分析流程图，展示从序列输入→全基因组扫描→脱靶位点识别→功能注释→风险分级的完整流程

4. 应用场景与服务优势

4.1 应用场景

（1）候选序列早期筛选：在药物设计阶段，对多个候选ASO/siRNA序列进行脱靶风险评估，优先选择脱靶风险低的序列进入后续开发；

（2）IND申报支持：提供符合监管要求的计算机脱靶预测报告，作为非临床安全性评估的重要组成部分；

（3）实验验证参考：为RNA-seq转录组验证实验提供预测性脱靶位点清单，计算机预测与实验验证的交叉分析可提升评估可信度；

（4）序列优化方向：基于脱靶位点的序列特征分析，为药物序列的优化设计提供科学依据；

（5）失败案例分析：对临床前或临床阶段出现安全性问题的候选药物，追溯分析潜在脱靶风险来源。

4.2 服务优势

（1）监管合规性：严格遵循FDA《寡核苷酸类药物的非临床安全性评估指南》（2024年）及相关ICH指导原则，评估范围与方法学符合监管要求；

（2）快速高效：计算机预测周期短（10个工作日），显著缩短研发周期，降低早期开发成本；

（3）专业可靠：基于多年核酸药物研发经验，整合多个权威生物信息学数据库，确保分析结果的准确性与全面性；

（4）定制化服务：支持人类、小鼠及其他常见模式生物，可根据客户靶点、适应症和研发阶段提供个性化分析方案；

（5）互补验证：计算机预测与RNA-seq转录组验证可独立或同步开展，二者交叉对比分析形成完整的脱靶评估体系。

5. 报告示例展示

舒桐科技提供的脱靶预测分析报告内容全面、结构清晰，包含脱靶位点详细注释、风险分级评估、功能富集分析等核心内容。以下展示部分报告关键结果（以某HBV靶向ASO项目为例）。

（1）脱靶位点预测结果：基于全基因组序列比对分析，系统识别了ASO序列及其代谢产物的潜在脱靶位点。预测结果包含每个脱靶位点的基因组坐标、所在基因/转录本、错配模式、链方向等详细注释信息。

图5 脱靶位点预测结果示例

（2）脱靶基因风险分级：整合组织表达数据、必需基因数据库及疾病关联数据库，对识别的脱靶基因进行多维度安全性评估，建立高、中、低三级风险分级体系，精准锁定需重点关注的脱靶位点。

图6 高风险脱靶基因必需性评估（LOEUF值）

（3）组织表达相关性分析：基于权威组织表达数据库，系统评估脱靶基因在药物作用的目标组织（肝脏）中的表达情况。筛选出在肝脏组织中表达的脱靶基因，作为后续安全性评估的重点关注对象。

图7 在靶组织（肝脏）表达的脱靶基因列表

（4）功能富集分析：对高、中风险脱靶基因进行GO功能富集与KEGG通路富集分析，系统解析脱靶基因的核心生物学功能及参与的关键信号通路，为脱靶效应的机制解析和风险评估提供科学依据。

图8 高风险脱靶基因GO功能富集分析

图9 中风险基因GO和KEGG富集结果可视化

6. 服务内容与交付

*交付内容：

（1）完整的脱靶位点注释数据集（Excel格式）；

（2）高风险脱靶基因清单及功能注释；

（3）脱靶预测分析报告（PDF格式）；

（4）功能富集分析结果及可视化图表。

7. 送样要求与项目周期

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics Guidance for Industry. Draft Guidance. November (2024).

[2] Yoshida, T. et al. Evaluation of off-target effects of gapmer antisense oligonucleotides using human cells. Genes Cells 24, 827–835 (2019).

[3] Andersson, P. et al. Assessing Hybridization-Dependent Off-Target Risk for Therapeutic Oligonucleotides: Updated Industry Recommendations. Nucleic Acid Ther. (2024).

[4] Goyenvalle, A. et al. Considerations in the preclinical assessment of the safety of antisense oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 33, 1–16 (2023).

[5] Kamola, P. J. et al. In silico and in vitro evaluation of exonic and intronic off-target effects form a critical element of therapeutic ASO gapmer optimization. Nucleic Acids Res. 43, 8638–8650 (2015).

[6] Lindow, M. et al. Assessing unintended hybridization-induced biological effects of oligonucleotides. Nat. Biotechnol. 30, 920–923 (2012).