ASO/siRNA在靶/脱靶RT-qPCR验证

ASO/siRNA在靶/脱靶RT-qPCR验证

1. 背景介绍

反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）作为新一代精准核酸药物,在罕见病、遗传性疾病及肿瘤治疗领域展现出巨大应用潜力。然而，这类药物在发挥靶向治疗作用的同时，可能因序列同源性与非预期基因发生杂交结合，引发脱靶效应，导致非靶标基因表达异常，进而产生潜在的安全性风险。

近年来,全球主要监管机构（ICH、FDA、PMDA等）及寡核苷酸安全工作组（OSWG）相继发布相关技术指导原则文件，明确要求ASO/siRNA药物在临床开发和IND申报前，需进行全面的序列依赖性脱靶评估。系统性的脱靶评估不仅能够识别潜在安全风险位点,更是监管机构审评过程中的重点关注内容。

图1 全球核酸药物主要监管文件时间线

RT-qPCR（实时荧光定量PCR）作为分子生物学的“金标准”检测技术，在ASO/siRNA脱靶评估体系中发挥着关键的验证作用。通过对计算机预测和RNA-seq转录组分析识别的潜在高风险脱靶位点进行靶向性定量验证，可精准评估脱靶效应的严重程度，为候选化合物的安全性评价和IND申报提供高置信度的实验数据支撑。

舒桐科技基于多年安全性评估服务经验，建立了标准化的RT-qPCR验证平台，为ASO/siRNA在靶敲降效率确认及高风险脱靶位点验证提供专业、可靠的技术服务。

2. 检测原理与策略

RT-qPCR验证通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，实现对目标基因mRNA表达水平的精确定量，其检测灵敏度可达单拷贝水平，是验证基因表达变化的权威方法。

在ASO/siRNA脱靶评估流程中，RT-qPCR验证发挥着双重关键作用：

（1）在靶基因敲降效率验证

在RNA-seq实验前或独立实验中，通过RT-qPCR精准定量目标基因的表达抑制程度，确认ASO/siRNA的靶向敲降有效性，为后续脱靶评估建立可靠的阳性对照。

（2）高风险脱靶位点确证

针对计算机预测和RNA-seq转录组分析识别的潜在疑似高风险脱靶位点，通过RT-qPCR进行独立验证，确认其表达变化的真实性和统计学显著性。这种交叉验证策略可有效排除假阳性信号，锁定需重点关注的真实脱靶位点，为后续IC50测定及安全窗口评估提供明确方向。

图2 脱靶评估技术路线（计算机预测→RNA-seq→RT-qPCR验证→IC50测定的完整流程）

3. 技术优势

（1）高灵敏度与准确性：RT-qPCR技术可检测低至单拷贝水平的基因表达变化，对于表达丰度较低的脱靶基因同样能够实现精准定量，确保不遗漏任何潜在安全风险位点。

（2）快速高效，成本合理：相比全转录组测序，RT-qPCR验证针对性强、周期短（7-18个工作日）、成本效益高，特别适用于候选化合物的快速筛选及关键脱靶位点的确证。

（3）独立验证，提升数据可信度：作为独立于RNA-seq的验证技术，RT-qPCR结果可与转录组数据形成交叉印证，显著提升脱靶评估结论的科学性和可靠性，满足监管机构对数据完整性的要求。

（4）标准化流程,符合监管要求：舒桐科技建立了涵盖引物设计验证、RNA质控、扩增效率校准、数据标准化的完整SOP体系，确保实验结果的重现性和可追溯性，可直接支持IND申报。

4. 应用场景

（1）在靶基因敲降效率确认：在药物设计阶段，快速验证候选ASO/siRNA序列对目标基因的敲降效果，为序列优化提供实验依据。

（2）高风险脱靶位点验证：针对计算机预测和RNA-seq分析识别的高风险脱靶基因，进行靶向性定量验证，确认表达变化的真实性,筛选需重点关注的脱靶位点。

（3）剂量依赖性评估：通过多浓度梯度实验，评估在靶基因和脱靶基因表达变化与药物浓度的关系，为后续IC50测定提供预实验数据。

（4）IND申报数据支持：提供符合FDA/NMPA监管要求的RT-qPCR验证报告，作为计算机预测和RNA-seq分析的验证数据，满足非临床安全性评估的完整性要求。

5. 报告内容

舒桐科技提供的RT-qPCR验证报告内容全面、数据严谨，包含以下核心模块：

（1）引物设计与验证

①针对目标基因设计特异性引物（18-25 bp,Tm值58-62°C）；

②标准曲线法验证引物扩增效率（90-110%）和特异性；

③熔解曲线分析确认产物单一性。

（2）RNA样本质量评估

①RNA浓度、纯度检测（A260/280、A260/230比值）；

②RNA完整性评估（RIN值或琼脂糖凝胶电泳）。

（3）定量检测结果

①各目标基因的Ct值及标准化后的相对表达量；

②实验组vs对照组的表达倍数变化（Fold Change）；

③统计学显著性分析（t检验或方差分析）。

（4）结果可视化

①目标基因表达柱状图（含误差棒）；

②剂量依赖性曲线图（若涉及浓度梯度实验）。

（5）质控数据

①内参基因稳定性评估；

②技术重复间变异系数（CV值）；

③阴性对照及阳性对照结果；

④所有数据均基于至少3个生物学重复，确保结果的统计学可靠性。

6. 服务内容与交付

6.1 服务流程

项目咨询 → 引物设计与验证 → RNA质检/样本处理 → RT-qPCR检测 → 数据分析 → 报告交付

6.2 交付内容

（1）RT-qPCR定量数据表（Excel格式）；

（2）专业分析报告（PDF格式），包含实验流程、质控数据、检测结果及统计分析；

（3）引物序列及验证数据；

（4）原始Ct值数据及计算过程。

7. 送样要求与项目周期

8. 参考文献

[1] U.S. Food and Drug Administration. Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics Guidance for Industry. Draft Guidance. November (2024).

[2] Yoshida, T. et al. Evaluation of off-target effects of gapmer antisense oligonucleotides using human cells. Genes Cells 24, 827–835 (2019).

[3] Andersson, P. et al. Assessing Hybridization-Dependent Off-Target Risk for Therapeutic Oligonucleotides: Updated Industry Recommendations. Nucleic Acid Ther. (2024).

[4] Goyenvalle A, et al. Considerations in the preclinical assessment of the safety of antisense oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2023; 33(1):1-16.