ASO/siRNA RNA-seq脱靶检测

ASO/siRNA RNA-seq脱靶检测

1. 背景介绍

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASO）和小干扰RNA（Small Interfering RNA，siRNA）作为新一代精准核酸药物，通过序列特异性识别靶标RNA，在基因表达层面实现精准调控，已成为罕见病、遗传性疾病、神经退行性疾病及代谢性疾病治疗的重要手段。ASO主要通过RNase H介导的mRNA降解或空间位阻效应发挥作用；siRNA则依赖RNA诱导沉默复合体（RISC）切割靶mRNA，具有更强的靶向特异性。相比传统小分子和抗体药物，核酸药物具有靶点覆盖广、设计周期短、序列可定制等显著优势，能够针对传统药物难以干预的靶点开发治疗方案，已在全球生物医药研发管线中占据重要战略地位。

随着多款ASO及siRNA药物相继在全球获批上市，覆盖脊髓性肌萎缩症、遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性、急性肝卟啉症、高胆固醇血症等多个适应症，核酸药物的临床价值与商业可行性已得到充分验证。与此同时，全球核酸药物研发管线持续扩张，大量候选分子进入临床前及临床开发阶段，市场前景广阔，成为当前生物医药领域最具增长潜力的赛道之一。

然而，核酸药物开发的成功率高度依赖于序列的精准设计与全面的安全性评估。ASO/siRNA的安全性风险主要来源于两个维度：其一为序列依赖性（杂交依赖性）脱靶效应——由于核酸序列的高度相似性，药物可能与非目标基因发生非预期杂交结合，引发杂交依赖性脱靶效应（Hybridization-Dependent Off-Target Effects），导致非靶标基因表达异常，是核酸药物临床前毒性信号的重要来源之一；其二为序列非依赖性效应——例如ASO可能引发的补体激活、凝血功能干扰等类效应（class effects），以及siRNA通过TLR7/TLR8等固有免疫受体激活所引发的免疫刺激反应等。近年来，国际ICH、全球主要监管机构（FDA、EMA、PMDA、CDE）及寡核苷酸安全工作组（OSWG）相继出台相关专项技术指导文件，对核酸药物的安全性评估提出明确且系统的要求：

图1 全球核酸药物主要监管文件时间线

FDA于2024年11月发布《寡核苷酸类药物非临床安全性评估指南》（Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics），明确要求在IND申报前，需对候选序列及其代谢产物开展覆盖转录组、核基因组及线粒体基因组的全面杂交依赖性脱靶评估，并结合RNA-seq转录组实验验证与计算机预测进行交叉分析。系统性、规范化的安全性评估，已成为核酸药物能否顺利推进IND申报的核心前提。

图2 FDA寡核苷酸药物序列依赖型脱靶杂交效应评估要求

（该指南明确要求采用in silico结合体外方法（包括RNA-seq）对ONTs潜在脱靶位点进行系统评估。）

2. 检测原理

RNA-seq脱靶检测基于高通量转录组测序技术，通过对比ASO/siRNA处理组与对照组的全基因组表达谱差异，系统性识别因序列同源性导致的非预期基因表达变化。

2.1 核心检测策略

（1）针对siRNA：主要检测成熟mRNA水平的脱靶效应。siRNA通过RISC复合体在细胞质中介导mRNA降解，因此采用mRNA富集建库策略（Oligo-dT磁珠富集poly(A)+ RNA），可高效捕获脱靶导致的mRNA表达下调事件。

（2）针对ASO：根据ASO类型灵活选择建库策略。Gapmer型ASO（RNase H依赖）可采用mRNA富集建库；而Splice-switching型ASO（调控核内pre-mRNA剪接）建议采用全转录组建库（rRNA去除），以全面评估核内外脱靶风险。

2.2 分析流程

通过专业的差异分析算法识别显著下调基因（|Log2FC| > 1，p < 0.05），结合序列同源性比对（允许≤3个碱基错配），交叉分析和确认计算机预测与RNA-seq实验结果，精准鉴定序列依赖性脱靶位点。同时进行功能富集分析，评估脱靶效应的生物学意义及潜在安全性风险。

图3 RNA-seq脱靶检测技术流程图

3. 技术优势与创新

3.1 全转录组覆盖，全面识别脱靶风险

基于高通量测序技术，实现对全基因组表达谱的无偏倚检测，相比传统qPCR验证方法可同时监测数万个基因的表达变化，避免遗漏潜在脱靶位点，确保脱靶评估的全面性和准确性。

3.2 高灵敏度，精准定量脱靶程度

测序深度达到5-10G数据量，能够可靠检测低丰度基因的表达变化，精准量化脱靶基因的表达上调或抑制程度，为后续安全窗口评估提供准确的定量数据。

3.3 多维度分析，深度解读脱靶机制

整合序列同源性分析、差异表达分析、功能富集分析、蛋白互作网络分析等多层次生物信息学方法，不仅识别脱靶位点，更深度解析脱靶基因的生物学功能、信号通路关联及潜在毒性风险，为安全性评估提供全面的数据支撑。

3.4 符合监管要求，支持IND申报

检测方法和分析流程严格遵循FDA 2024年最新指南及OSWG行业共识，交付的分析报告包含完整的数据质量评估、脱靶位点鉴定、功能注释及风险评估，可直接用于IND申报的非临床安全性评价模块，满足监管机构的审评要求。

3.5 灵活的建库策略，针对性优化检测效能

针对不同类型寡核苷酸药物的作用机制特点，提供差异化的建库方案：siRNA项目采用mRNA富集建库，ASO项目可根据化合物类型选择mRNA富集或全转录组建库，在保证检测全面性的同时优化成本效益，实现检测策略的精准匹配。

3.6 计算预测与实验验证交叉比对

创新性整合计算机序列同源性预测与RNA-seq实验验证，对预测的潜在脱靶位点与实际表达下调基因进行交叉验证分析。这种双重确认机制显著提高了脱靶位点鉴定的准确性，有效区分真实脱靶效应与生物学噪音，降低假阳性率。

3.7 系统化的脱靶分析体系

建立标准化的脱靶分析流程，涵盖全序列匹配分析、Seed区匹配分析（针对siRNA）、剂量依赖性评估、组织表达相关性分析、基因功能重要性评估等多维度内容，构建完整的脱靶风险评估矩阵，为候选化合物优化提供清晰的决策依据。

4. 应用场景

RNA-seq脱靶检测技术适用于寡核苷酸药物研发的多个关键阶段：

（1）候选化合物优选：在临床前阶段，通过转录组脱靶分析筛选安全性更优的候选序列；

（2）IND申报支持：满足监管机构对脱靶评估的数据完整性要求，提供符合 FDA/NMPA 标准的分析报告；

（3）临床安全监测：为临床试验中的不良事件溯源提供分子机制层面的数据支撑。

5. 示例报告内容展示

为确保客户全面了解服务交付成果，我们提供专业化、规范化的检测分析报告。以下以 siRNA RNA-seq 脱靶分析报告为例展示核心分析模块（注：ASO 脱靶分析在策略上有所不同，主要体现在脱靶位点识别基于全长序列同源性分析而非 seed 区匹配，建库方式可选全转录组或 mRNA 富集，其余分析流程基本一致）。报告涵盖从数据质控到脱靶风险评估的完整分析链条，所有结论均基于严格的统计学检验，可直接支持 IND 申报及研发决策。

（1）数据质量评估与差异表达分析：报告首先呈现测序数据的质量控制结果，包括原始数据与质控后数据的 Q20/Q30 比例、序列比对率等核心指标，确保后续分析建立在高质量数据基础上。随后通过 DESeq2 算法进行差异表达分析，以火山图直观展示全转录组表达变化全景，并统计上调/下调基因数量，通过火山图清晰标注显著差异基因的分布位置。

图4 差异表达基因统计表

图5 差异表达分析火山图

（2）靶标基因敲降效率验证：针对客户指定的核心靶标基因（示例中为 nudt21，基因ID: ENSG00000167005），报告提供专门的表达变化评估。示例结果显示该靶标基因 log2FoldChange 为 -0.653，FoldChange 为 0.636，padj 为 0.0012，呈现显著下调趋势，验证了 siRNA 的靶向敲降有效性。

图6 靶标基因差异分析表

（3）脱靶位点预测与交叉验证分析：基于 siRNA 的 seed 区序列匹配原理（第 2-8 位核苷酸），报告系统识别四种潜在脱靶类型：mer8（8 碱基完全匹配）、mer7m8（7 碱基匹配含第8位）、mer7A1（7 碱基匹配含第1位A）、mer6（6 碱基匹配），并统计各类型的预测脱靶基因数量。关键创新在于将计算预测结果与实际差异表达基因进行交叉比对，筛选出“既有序列互补性、又确实表达改变”的高置信度脱靶基因。示例报告显示四种类型预测脱靶基因分别为 383、2129、1023、2245 个，与差异基因交集发现 1 个共同基因（属于 mer7m8 类型），该基因即为需重点关注的真实脱靶位点。

图7 差异基因与潜在脱靶基因交集表

（4）脱靶效应统计学评估与可视化：通过 Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验量化 siRNA 对各类型潜在脱靶基因的整体影响。示例报告中四种匹配类型的 P 值均 < 0.05，表明 siRNA 对这些潜在脱靶基因的表达影响与背景基因存在显著差异，证实脱靶效应的存在。报告同时提供累积分布函数（ECDF）曲线，直观展示各类型脱靶基因与背景基因的表达分布差异，曲线偏移程度反映脱靶风险强度。这一统计学证据是监管机构重点关注的核心数据。

图8 K-S 检验统计结果表（包含四种 merk 类型的 D 统计量和 P 值）

图9 ECDF累积分布曲线图

6. 服务内容与流程

舒桐科技提供灵活的服务模式，客户可根据实际情况进行选择。

6.1 服务选项

选项一：客户提供样本

（1）适用场景：客户已完成细胞转染实验；

（2）送样要求：提供转染后的细胞样本或已提取的RNA样本（实验组+对照组，≥3个生物学重复）；

（3）服务内容：RNA质检、文库构建、高通量测序、生物信息学分析；

（4）项目周期：35个工作日。

选项二：舒桐全流程服务

（1）适用场景：客户提供ASO/siRNA化合物，舒桐科技完成全流程实验；

（2）送样要求：提供ASO/siRNA化合物及靶标信息，明确细胞系选择及实验设计需求；

（3）服务内容：细胞培养、化合物转染、RNA提取与质检、文库构建、高通量测序、生物信息学分析；

（4）项目周期：45个工作日。

6.2 交付内容

（1）专业的RNA-seq脱靶分析报告（PDF格式），包含数据质量评估、差异表达分析、脱靶位点鉴定、功能富集分析等完整内容；

（2）原始测序数据（FASTQ格式）；

（3）数据分析中间文件及结果文件；

（4）可根据客户需求提供符合IND申报要求的补充技术文档。

7. 样本要求

8. 参考文献

[1] Yoshida T, et al. Evaluation of off-target effects of gapmer antisense oligonucleotides using human cells. Genes Cells. 2019; 24(11):827-835.

[2] Andersson P, et al. Assessing Hybridization-Dependent Off-Target Risk for Therapeutic Oligonucleotides: Updated Industry Recommendations. Nucleic Acid Ther. 2024.

[3] Goyenvalle A, et al. Considerations in the preclinical assessment of the safety of antisense oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2023; 33(1):1-16.

[4] Lindow M, et al. Assessing unintended hybridization-induced biological effects of oligonucleotides. Nat Biotechnol. 2012; 30(10):920-923.

[5] Kamola PJ, et al. In silico and in vitro evaluation of exonic and intronic off-target effects form a critical element of therapeutic ASO gapmer optimization. Nucleic Acids Res. 2015; 43(18):8638-8650.

[6] U.S. Food and Drug Administration. Nonclinical Safety Assessment of Oligonucleotide-Based Therapeutics Guidance for Industry. Draft Guidance. November 2024.