甲基化靶向捕获测序
甲基化靶向捕获测序
1. 背景介绍
甲基化靶向捕获测序(Targeted Methylation Capture Sequencing)技术结合了RRBS的广覆盖优势和扩增子测序的靶向性，通过设计针对特定基因组区域的探针进行杂交富集，实现对目标区域的高深度甲基化检测。该技术特别适合于中等规模(0.5M-5M)的功能区域研究，在成本和覆盖范围之间取得了良好平衡。
随着表观基因组学研究的深入，研究人员发现许多疾病相关的甲基化变化集中在特定的基因组区域，如启动子、增强子、CpG岛岸等调控元件。靶向捕获技术允许研究人员聚焦于这些功能重要区域，以较低的成本获得高质量的甲基化数据，同时避免了全基因组测序的巨大数据量和分析负担。
该技术已被广泛应用于肿瘤表观遗传学、复杂疾病研究、药物靶点发现等领域。通过定制化的panel设计，可以针对特定疾病或生物学过程相关的基因集进行深度甲基化分析，为精准医学和转化研究提供有力支持。
2. 甲基化靶向捕获检测原理
甲基化靶向捕获技术的核心原理是利用生物素标记的探针与目标DNA区域进行液相杂交，通过链霉亲和素磁珠特异性富集含有目标序列的DNA片段。整个流程在亚硫酸氢盐转化后进行，确保既能捕获目标区域，又能保留甲基化信息。
检测流程包括：首先对高质量基因组DNA进行片段化(200-300bp)，经末端修复和接头连接后，进行亚硫酸氢盐转化处理；随后根据目标区域设计一组覆盖性探针(通常为120bp寡核苷酸)，这些探针针对转化后的序列设计，能同时识别甲基化和非甲基化状态的DNA；将转化后的文库与探针进行液相杂交(通常16-24小时)，使探针与目标序列充分结合；利用链霉亲和素磁珠捕获生物素标记的探针-DNA复合物，通过严格的洗涤步骤去除非特异性结合；最后对富集的DNA进行PCR扩增并测序。
通过生物信息学分析，将测序reads比对到目标区域，计算每个CpG位点的甲基化水平。该方法可实现100-500X的平均覆盖深度，足以进行准确的甲基化定量和差异分析。相比PCR扩增，探针捕获具有更好的均一性和更低的GC偏好性。
图1 甲基化靶向捕获测序技术流程示意图
3. 技术创新与优势
3.1 甲基化靶向捕获技术优势
甲基化靶向捕获和其他甲基化测序技术相比存在一定优势，体现在灵活性最强（完全可定制）、均一性最好（低GC偏好，高捕获均一性）深度覆盖（目标区域可达到极高测序深度）精准聚焦（ 避免测序浪费，集中资源于关注区域），特别适合:
（1）已明确研究的候选基因或区域；
（2）需要极高深度覆盖进行精细定量；
（3）多基因panel的临床诊断应用；
（4）从WGBS/RRBS发现到验证的过渡阶段；
（5）需要定期更新目标区域的长期项目。
图2 主流甲基化测序技术综合性能比较
3.2 智能化探针设计策略
开发先进的探针设计系统，确保高效捕获：
(1) 双链设计：针对亚硫酸氢盐转化后的正链和负链分别设计探针，确保捕获效率；
(2) 高密度覆盖：探针间隔设计，确保目标区域无盲点覆盖；
(3) 重复序列处理：优化重复序列区域的探针设计，提高这些难捕获区域的覆盖；
(4) Panel灵活性：支持预设panel(如肿瘤相关基因、印记基因等)或全定制panel设计。
3.3 优化的杂交捕获体系
建立高效的杂交捕获流程：
(1) 优化杂交条件：精确控制温度、时间和反应体系，提高捕获特异性和效率；
(2) 严格洗涤策略：多步骤梯度洗涤，有效去除非特异性结合，降低背景噪音；
(3) 多样本并行：支持多个样本同时杂交捕获，提高实验效率；
(4) 质控体系：每批次包含阳性对照和阴性对照，确保捕获效率达标。
3.4 专业的生物信息学分析
提供全方位的数据分析服务：
(1) 捕获效率评估：on-target rate分析、覆盖均一性评估；
(2) 甲基化定量：单CpG位点和区域甲基化水平计算；
(3) 差异甲基化分析：DMR鉴定、统计检验、效应量评估；
(4) 功能注释：基因功能、通路富集、疾病关联分析；
(5) 多维度可视化：环形图、热图、基因组浏览器视图等。
4. 应用场景与服务优势
4.1 应用场景
甲基化靶向捕获测序技术在多个研究领域具有独特优势：
(1) 特定通路甲基化研究：如Wnt通路、p53通路、细胞周期通路等关键信号通路相关基因；
(2) 疾病相关基因panel：肿瘤相关基因、神经退行性疾病基因、代谢疾病基因等；
(3) 调控元件甲基化分析：启动子、增强子、CpG岛岸、转录因子结合位点等；
(4) 印记基因研究：检测印记控制区(ICR)和印记基因簇的甲基化状态；
(5) 候选区域深度分析：GWAS或EWAS鉴定的候选区域的精细甲基化图谱；
(6) 药物靶点甲基化：评估药物作用相关基因的甲基化变化；
(7) 进化表观遗传学：跨物种保守区域的甲基化比较研究；
(8) iPSC细胞治疗和表观遗传变异基因编辑：iPSC重编程和分化过程中的甲基化监测、基因编辑对表观遗传的影响评估、iPSC治疗产品的质量控制、iPSC分化过程中的表观遗传重塑追踪。
4.2 服务优势
(1) 平衡性价比：成本比WGBS降低70-80%，覆盖范围比扩增子测序扩大100-1000倍；
(2) 灵活panel设计：支持0.5M到5M的不同规模panel，可根据研究需求定制；
(3) 高数据质量：探针捕获技术GC偏好性低，覆盖均一性优于PCR方法；
(4) 预设panel可选：提供肿瘤、神经、代谢等多种疾病相关的标准panel；
(5) 技术成熟：基于成熟商业化捕获平台；
(6) 快速交付：标准服务周期5-7周，加急服务4周；
(7) 完善分析：提供从基础分析到高级分析的全套生物信息学服务。
5. 甲基化靶向捕获测序分析报告示例
我们提供全面专业的靶向捕获甲基化分析报告，包含以下核心内容：
（1）数据质量评估：测序数据量、Q30比例、GC含量、重复率、比对率等关键指标；
Sample | Total_Reads_M | Clean_Reads_M | Q30_Percent | GC_Content | Duplication_Rate | Mapping_Rate |
Ctrl1 | 45.2 | 43.8 | 92.3 | 48.2 | 12.3 | 87.5 |
Ctrl2 | 48.1 | 46.5 | 93.1 | 47.8 | 11.8 | 88.2 |
Ctrl3 | 46.8 | 45.2 | 92.8 | 48.5 | 13.1 | 87.8 |
Exp1 | 44.9 | 43.4 | 91.9 | 48.1 | 12.6 | 87.1 |
Exp2 | 47.3 | 45.8 | 92.6 | 47.9 | 11.9 | 88 |
Exp3 | 46.5 | 45.1 | 92.4 | 48.3 | 12.4 | 87.6 |
（2）捕获效率统计：On-target率、富集倍数、目标区域覆盖统计；
Sample | On_Target_Rate | Enrichment_Fold | Target_Region_Coverage_1X | Target_Region_Coverage_10X | Target_Region_Coverage_20X | Target_Region_Coverage_50X |
Ctrl1 | 68.5 | 142 | 98.5 | 96.2 | 92.8 | 85.3 |
Ctrl2 | 70.2 | 156 | 98.9 | 97.1 | 94.2 | 87.5 |
Ctrl3 | 69.1 | 148 | 98.7 | 96.8 | 93.5 | 86.2 |
Exp1 | 67.8 | 138 | 98.3 | 95.9 | 92.1 | 84.6 |
Exp2 | 69.8 | 152 | 98.8 | 96.9 | 93.8 | 86.9 |
Exp3 | 68.9 | 145 | 98.6 | 96.5 | 93.2 | 85.8 |
（3）覆盖深度分布：累积覆盖曲线、深度分布直方图、均一性评估；
Threshold | Ctrl1 | Ctrl2 | Ctrl3 | Exp1 | Exp2 | Exp3 |
1 | 98.5 | 98.5 | 98.5 | 98.2 | 98.2 | 98.2 |
5 | 98.35 | 98.35 | 98.35 | 98.05 | 98.05 | 98.05 |
10 | 98.2 | 98.2 | 98.2 | 97.9 | 97.9 | 97.9 |
20 | 98.05 | 98.05 | 98.05 | 97.75 | 97.75 | 97.75 |
30 | 97.9 | 97.9 | 97.9 | 97.6 | 97.6 | 97.6 |
40 | 97.75 | 97.75 | 97.75 | 97.45 | 97.45 | 97.45 |
50 | 97.6 | 97.6 | 97.6 | 97.3 | 97.3 | 97.3 |
60 | 97.45 | 97.45 | 97.45 | 97.15 | 97.15 | 97.15 |
70 | 97.3 | 97.3 | 97.3 | 97 | 97 | 97 |
80 | 97.15 | 97.15 | 97.15 | 96.85 | 96.85 | 96.85 |
90 | 97 | 97 | 97 | 96.7 | 96.7 | 96.7 |
100 | 96.85 | 96.85 | 96.85 | 96.55 | 96.55 | 96.55 |
（4）转化效率评估：通过非CpG context评估亚硫酸氢盐转化效率；
Sample | CHH_Conversion | CHG_Conversion | Overall_Conversion |
Ctrl1 | 99.45 | 99.38 | 99.42 |
Ctrl2 | 99.52 | 99.46 | 99.49 |
Ctrl3 | 99.48 | 99.42 | 99.45 |
Exp1 | 99.41 | 99.35 | 99.38 |
Exp2 | 99.5 | 99.44 | 99.47 |
Exp3 | 99.46 | 99.4 | 99.43 |
（5）CpG覆盖统计：目标区域CpG位点覆盖数量和覆盖比例；
Sample | Total_Target_CpGs | Covered_CpGs_1X | Covered_CpGs_10X | Covered_CpGs_20X | Coverage_Rate_1X | Coverage_Rate_10X | Coverage_Rate_20X |
Ctrl1 | 285000 | 278450 | 268200 | 255300 | 97.7 | 94.1 | 89.6 |
Ctrl2 | 285000 | 280125 | 271350 | 259800 | 98.3 | 95.2 | 91.2 |
Ctrl3 | 285000 | 279340 | 269780 | 257450 | 98 | 94.7 | 90.3 |
Exp1 | 285000 | 277680 | 266940 | 253890 | 97.4 | 93.7 | 89.1 |
Exp2 | 285000 | 279850 | 270560 | 258920 | 98.2 | 94.9 | 90.8 |
Exp3 | 285000 | 278920 | 268850 | 256340 | 97.9 | 94.3 | 89.9 |
（6）甲基化水平分析：全局甲基化水平、基因组元件甲基化分布、样本间比较；
Sample | Global_Methylation | Promoter_Methylation | Gene_Body_Methylation | CpG_Island_Methylation | CpG_Shore_Methylation | Enhancer_Methylation |
Ctrl1 | 42.5 | 28.3 | 58.2 | 15.2 | 45.8 | 38.5 |
Ctrl2 | 43.2 | 29.1 | 59.1 | 16.1 | 46.5 | 39.2 |
Ctrl3 | 42.8 | 28.7 | 58.6 | 15.6 | 46.1 | 38.8 |
Exp1 | 51.3 | 38.5 | 62.8 | 25.8 | 54.2 | 47.3 |
Exp2 | 50.8 | 37.9 | 62.1 | 24.9 | 53.6 | 46.8 |
Exp3 | 51.6 | 39.2 | 63.4 | 26.5 | 55.1 | 48.1 |
（7）差异甲基化分析：DMR鉴定、差异CpG位点筛选、火山图和热图展示；
1. 差异DMR结果示例:
DMR_ID | Chromosome | Start | End | Gene | Methylation_Difference | P_value | FDR | Ctrl_Mean_Methylation | Exp_Mean_Methylation |
DMR_002 | chr17 | 14694219 | 14696146 | RB1 | 16.41 | 4.98E-04 | 1.27E-03 | 45.38 | 68.29 |
DMR_008 | chr1 | 38878569 | 38879789 | PTEN | 31.19 | 5.69E-06 | 2.75E-05 | 36.66 | 58.38 |
DMR_010 | chr19 | 1223365 | 1223792 | KRAS | 24.49 | 1.96E-05 | 8.40E-05 | 20.69 | 58.41 |
2.差异CpG位点结果示例
CpG_ID | Chromosome | Position | Methylation_Difference | P_value | FDR | Ctrl_Mean | Exp_Mean |
CpG_00923 | chr2 | 41279066.00 | 25.52 | 2.62E-10 | 1.67E-08 | 50.44 | 78.53 |
CpG_00040 | chr3 | 22770604.00 | 20.04 | 1.19E-05 | 1.15E-04 | 46.73 | 90.68 |
CpG_00497 | chr3 | 1728894.00 | 18.12 | 6.96E-04 | 1.92E-03 | 34.18 | 23.22 |
图3 火山图、热图和差异甲基化分析统计结果
（8）重点基因展示：关键基因的甲基化模式可视化、与已知数据库比较；
Gene | Region | Sample | Methylation |
BRCA1 | Promoter | Ctrl1 | 28.61 |
BRCA1 | Promoter | Ctrl2 | 29.22 |
BRCA1 | Promoter | Ctrl3 | 18.32 |
BRCA1 | Promoter | Exp1 | 43.42 |
BRCA1 | Promoter | Exp2 | 62.52 |
BRCA1 | Promoter | Exp3 | 40.59 |
图4 关键基因甲基化水平柱状图，甲基化水平变化曲线图
（9）原始数据：提供甲基化原始数据表、覆盖度信息，支持进一步分析。
6. 甲基化靶向捕获测序服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询 | Panel设计咨询、预设panel推荐、测序策略讨论 |
探针设计与合成 | 根据目标区域设计捕获探针，探针合成与质检 |
样本质检 | DNA浓度、纯度、完整性全面检测 |
文库构建 | DNA片段化、末端修复、接头连接、亚硫酸氢盐转化 |
杂交捕获 | 液相杂交、磁珠捕获、严格洗涤、PCR扩增 |
高通量测序 | Illumina平台PE150测序，数据量根据panel大小设计 |
数据分析 | 捕获效率评估、甲基化定量、差异分析、功能注释 |
报告交付 | 提供完整分析报告、原始数据、技术支持 |
增值服务 | 候选位点验证、多组学联合分析、定制化深度分析 |
7. 样本要求
类别 | 具体要求 |
DNA样本标准 | ·总量：≥1μg (标准)，≥500ng (少量样本模式)； ·浓度：≥50ng/μL； ·纯度：OD260/280=1.8~2.0， OD260/230≥1.8； ·完整性：主带清晰，无明显降解，片段>10kb。 |
Panel信息 | ·选择预设panel或提供定制panel的目标区域信息； ·目标区域总大小建议0.5M-5M，确保合理的捕获效率； ·提供参考基因组版本(如hg38， mm10等)。 |
实验分组 | ·建议每组≥3个生物学重复，以确保统计学显著性。 |
样本信息 | ·样本编号、类型、分组信息； ·物种信息及详细实验设计； ·研究目的和关注的生物学问题。 |
其他样本类型 | ·可提供组织(>100mg)或细胞(>5×10⁷)样本，我们提供DNA提取服务。 |
*注：①对于特殊样本或定制panel，建议提前与技术团队沟通，评估技术可行性。②所有样本须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] Lee, E. J., et al. (2011). Targeted bisulfite sequencing by solution hybrid selection and massively parallel sequencing. Nucleic Acids Research, 39(19), e127.
[2] Ivanov, M., et al. (2013). In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research, 41(6), e72.
[3] Shen, L., et al. (2013). Genome-wide profiling of DNA methylation reveals a class of normally methylated CpG island promoters. PLoS Genetics, 9(4), e1003388.
[4] Mulqueen, R. M., et al. (2018). Highly scalable generation of DNA methylation profiles in single cells. Nature Biotechnology, 36(5), 428-431.