单细胞转录组测序（perturb-seq）
单细胞转录组测序（perturb-seq）
1. 背景介绍
CRISPR基因编辑技术与单细胞转录组测序的结合开创了功能基因组学研究的新范式。传统的CRISPR筛选依赖于表型读出（如细胞存活、荧光标记），只能获得有限的终点信息。而Perturb-seq（CRISPR扰动转录组测序）技术通过在单细胞水平同时检测gRNA身份和全转录组表达谱，能够系统性地解析基因扰动对细胞状态的影响，揭示基因功能、调控网络和细胞命运决定机制[1,2]。
在细胞治疗领域，Perturb-seq技术具有广泛的应用前景。对于CAR-T细胞产品，可以系统性筛选增强持久性、减少耗竭的靶点基因；对于iPSC来源的细胞产品，可以解析分化过程中的关键调控因子；对于基因编辑治疗产品，可以评估编辑后细胞的转录组变化和功能状态[3,4]。这种将基因扰动与转录组读出相结合的策略，为理解复杂的细胞生物学过程和优化细胞治疗产品设计提供了强大工具。
舒桐科技建立了完善的单细胞CRISPR扰动转录组测序分析平台，支持从gRNA文库设计、细胞扰动实验到单细胞测序和生物信息学分析的全流程服务，为基因功能研究和细胞治疗产品开发提供系统性解决方案。
2. 单细胞CRISPR扰动转录组测序检测原理
单细胞CRISPR扰动转录组测序（Perturb-seq）的核心原理是在单细胞水平同时捕获两类信息：（1）细胞携带的gRNA序列，用于确定该细胞受到的基因扰动类型；（2）全转录组mRNA表达谱，用于反映基因扰动后的细胞状态变化。通过将这两类信息在单细胞水平进行关联，可以直接建立基因扰动与转录组响应之间的因果关系。
技术流程包括：首先构建含有gRNA序列和Poly(A)尾的CRISPR扰动文库，转导目标细胞并进行功能筛选或培养；随后使用10x Genomics等单细胞平台对扰动后的细胞进行单细胞RNA测序，同时通过特异性引物捕获gRNA序列；测序数据经过专业生物信息学分析流程处理，包括gRNA身份鉴定、转录组定量、差异表达分析、通路富集分析和调控网络推断等，最终获得每个基因扰动对应的转录组特征图谱。
图1 单细胞CRISPR扰动转录组测序技术流程示意图
3. 单细胞CRISPR扰动转录组测序技术创新与优势
3.1 核心技术创新
3.1.1 高通量多基因并行扰动
支持大规模基因功能筛选，显著提升研究效率：
（1）单次实验可同时扰动数十至数百个基因靶点；
（2）支持CRISPRi（干扰）、CRISPRa（激活）和CRISPRko（敲除）多种扰动模式；
（3）兼容组合扰动设计，解析基因间相互作用关系。
3.1.2 单细胞分辨率转录组读出
突破传统bulk筛选局限，获取丰富的细胞状态信息：
（1）每个细胞独立获取gRNA身份和全转录组表达谱；
（2）识别扰动响应的细胞异质性和亚群特异性效应；
（3）支持细胞轨迹分析，解析动态过程中的基因功能。
3.1.3 系统性基因功能注释
提供多层次的功能解析和调控网络推断：
（1）基于转录组特征进行基因功能聚类和注释；
（2）构建基因调控网络，识别上下游调控关系；
（3）预测基因扰动的表型效应和治疗潜力。
3.2 方法学验证与性能指标
舒桐科技对单细胞CRISPR扰动转录组测序平台进行了全面系统验证，确保数据质量和分析准确性：
验证参数 | 验证结果 |
gRNA捕获效率 | >85%的细胞可成功检测到gRNA身份 |
gRNA分配准确性 | >95%的细胞可明确分配单一gRNA身份，多重感染率<5% |
转录组数据质量 | 中位基因检出数>3,000，中位UMI数>10,000 |
扰动效果验证 | 靶基因表达下调>70%（CRISPRi/ko），上调>3倍（CRISPRa） |
细胞通量 | 单次实验可分析10,000-100,000个单细胞 |
重复性 | 技术重复间转录组特征Pearson相关系数>0.90 |
4. 应用场景与服务优势
4.1 应用场景
单细胞CRISPR扰动转录组测序技术在多个领域具有广泛应用：
（1）CAR-T/细胞治疗产品优化：系统性筛选增强T细胞持久性、减少耗竭的靶点基因；
（2）基因编辑效应评估：解析CRISPR编辑后细胞的转录组变化和功能状态；
（3）药物靶点发现与验证：高通量筛选疾病相关基因功能，识别潜在治疗靶点；
（4）细胞分化机制研究：解析iPSC/干细胞分化过程中的关键调控因子；
（5）基因调控网络构建：系统性解析转录因子和信号通路的调控关系；
（6）肿瘤生物学研究：识别肿瘤发生发展的关键驱动基因和脆弱性靶点。
4.2 服务优势
（1）全流程服务：提供从gRNA文库设计、细胞扰动实验到测序分析的一站式解决方案；
（2）平台成熟：基于10x Genomics等主流单细胞平台，技术体系成熟稳定；
（3）认证质量管理：实验室同时运行ISO9001质量管理体系与CNAS认可标准；
（4）专业分析团队：具备丰富的单细胞数据分析和CRISPR筛选分析经验；
（5）定制化分析：支持客户特定需求的个性化分析和深度挖掘。
5. 单细胞CRISPR扰动转录组测序示例报告
舒桐科技提供全面的单细胞CRISPR扰动转录组测序分析报告，包含测序数据质量评估、细胞过滤统计等基础信息。报告核心内容包括：
（1）gRNA身份鉴定与分配分析：统计每个gRNA的细胞捕获数量和分布，评估文库覆盖度和gRNA分配质量，识别多重感染和未分配细胞。
图2 gRNA身份分配统计与质量评估图
（2）扰动效果验证分析：评估每个gRNA对应靶基因的表达变化，验证CRISPRi/ko的敲低效果或CRISPRa的激活效果，筛选有效扰动细胞群体。图4展示了8个靶基因的扰动效果验证： 前6个基因显示敲低效果（蓝色对照 vs 红色扰动） 后2个基因显示激活效果（蓝色对照 vs 绿色激活）。
图3 靶基因表达敲低/激活效果验证图
（3）转录组特征聚类分析：对不同基因扰动的转录组特征进行降维和聚类分析，识别具有相似功能效应的基因群组，构建基因功能分类图谱。
图4 扰动转录组特征UMAP聚类分析图
（4）差异表达与通路富集分析：对每个基因扰动进行差异表达分析，识别显著上调和下调基因，进行GO功能富集和KEGG通路分析，解析扰动的生物学效应。
图5 差异表达基因火山图与通路富集分析图
（5）基因调控网络构建：基于扰动-响应关系推断基因调控网络，识别关键转录因子和调控枢纽，构建信号通路调控模型。
图6 基因调控网络可视化分析图
（6）细胞状态变化分析：评估基因扰动对细胞状态的影响，包括细胞周期、凋亡、分化状态等，识别影响细胞命运决定的关键基因。
图7 扰动诱导的细胞状态变化分析图
6. 单细胞CRISPR扰动转录组测序服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询与评估 | 确定研究目标和筛选策略，制定个性化实验方案 |
gRNA文库设计 | 根据靶基因列表设计gRNA序列，构建扰动文库 |
细胞扰动实验 | 病毒包装、细胞转导、筛选和培养（可选） |
样本接收与质检 | 严格按标准对细胞样本进行质检，确保符合上机要求 |
单细胞建库测序 | 10x Genomics单细胞RNA测序，同步捕获gRNA序列 |
生物信息学分析 | gRNA鉴定、转录组分析、差异表达、通路富集、调控网络推断 |
专业报告交付 | 提供标准化分析报告，含技术解读与咨询服务 |
深度定制分析 | 可按客户需求提供个性化深度挖掘和机制研究支持 |
7. 样本要求
类别 | 具体要求 |
服务选项 | ·全流程服务：从gRNA文库设计到测序分析； ·测序分析服务：客户提供扰动后细胞样本； ·纯分析服务：客户提供测序数据。 |
细胞样本标准 | ·细胞数量：≥1×106个活细胞/样本； ·细胞活力：≥85%； ·细胞状态：单细胞悬液，无明显团块； ·保存条件：新鲜细胞优先，冻存细胞需提前评估。 |
实验分组要求 | ·建议包含非靶向对照gRNA（NT-gRNA）样本。 |
客户需提供信息 | ·靶基因列表或gRNA序列信息； ·细胞类型和培养条件说明； ·扰动模式（CRISPRi/CRISPRa/CRISPRko）； ·研究目标和关注的生物学问题。 |
增值服务 | ·组合扰动实验设计； ·时序扰动动态分析； ·靶点验证和功能实验支持。 |
*注：①所有样本必须符合上述质量标准；②对于特殊细胞类型或实验设计，请提前与舒桐技术团队沟通（电话15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] Dixit A, et al. (2016). Perturb-Seq: Dissecting Molecular Circuits with Scalable Single-Cell RNA Profiling of Pooled Genetic Screens. Cell, 167(7):1853-1866.
[2] Adamson B, et al. (2016). A Multiplexed Single-Cell CRISPR Screening Platform Enables Systematic Dissection of the Unfolded Protein Response. Cell, 167(7):1867-1882.
[3] Replogle JM, et al. (2022). Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq. Cell, 185(14):2559-2575.
[4] Ursu O, et al. (2022). Massively parallel phenotyping of coding variants in cancer with Perturb-seq. Nat Biotechnol, 40(6):896-905.