PE先导编辑效率检测
PE先导编辑效率检测
1. 背景介绍
Prime Editing（先导编辑，简称PE）是由David R. Liu团队于2019年开发的新一代精准基因编辑技术[1]。与传统CRISPR-Cas9相比，PE无需引入双链断裂（DSB），通过pegRNA引导Prime Editor切割靶点单链DNA，随后以pegRNA携带的逆转录模板为蓝本合成新序列，经细胞内源DNA修复机制完成基因组精确修改。PE技术理论上可实现全部12种碱基转换、精确插入及精确缺失，编辑灵活性和精确性显著优于前代技术，显著降低了染色体重排和大片段缺失等风险。
目前，CBE和ABE两类碱基编辑器仅能实现有限类型的单碱基转换，而PE的出现将基因编辑的适用突变类型大幅拓展，为镰状细胞病、Tay-Sachs病等由复杂突变驱动的遗传疾病提供了全新的治疗思路。Prime Medicine等公司已将PE技术推进至临床前及临床试验阶段，标志着该技术正加速向临床应用转化。
随着基因编辑技术的持续演进，近年来，全球范围内的监管机构，包括美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）下属的药品审评中心（CDE），均对包括Prime Editing在内的基因编辑产品的安全性，特别是脱靶效应、染色体结构变异、载体整合风险以及编辑工具残留等问题，提出了全面而严格的评估要求[4-7]。美国FDA于2024年1月发布的指导原则《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》中明确要求基因编辑产品须开展全面的脱靶风险评估，强调应综合运用生物信息学、生化及细胞水平等多种方法进行全基因组范围分析，并对染色体完整性、克隆扩增风险及编辑产物的生物学效应进行系统评价（图1）。
图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》对基因编辑产品安全性评估的核心要求
针对PE产生的编辑结果，传统PCR结合Sanger测序的检测方法因灵敏度有限（检出限约10%–20%），难以准确量化低频编辑事件，且通量低、无法全面覆盖编辑窗口内的多位点碱基变化，难以满足当前监管对基因编辑产品精准评估的要求。针对上述检测痛点，舒桐科技基于高通量二代测序（NGS）技术，开发了专门优化的PE在靶扩增子检测平台，通过针对编辑靶点上下游设计特异性引物进行高深度扩增测序，可精准量化预期编辑效率，系统检测各类非预期突变的类型与占比，既满足科研阶段的编辑产物精细表征需求，也为IND申报提供符合监管要求的完整评估数据。
2. PE先导编辑效率检测原理
Prime Editing编辑效率检测技术基于新一代测序（NGS）的超高通量和单碱基分辨率能力，结合针对Prime Editing复杂编辑模式专门设计的实验流程和生物信息学分析管线。该技术通过特异性扩增包含编辑靶点及其侧翼序列的基因组区域（通常150-300bp），利用超深度测序（≥1,000,000×）和高级序列比对算法，实现对所有编辑产物的精确识别和定量。
检测流程包括：首先根据pegRNA的spacer序列和RT template设计高特异性扩增引物，确保完整覆盖编辑靶点、插入/删除区域以及侧翼序列；随后进行高保真PCR扩增和文库构建；通过MGI平台进行超深度双端测序（PE150），保证每个编辑位点获得≥1,000,000条有效reads；最后应用专门开发的Prime Editing分析算法，精确识别并量化预期编辑（精确替换/插入/删除）、非预期Indel、非预期碱基替换、以及各种复杂编辑组合的发生频率和序列特征。
相比常规NGS扩增子测序，该技术平台具有四大核心优势：（1）超高灵敏度——检测限达0.1%，能够发现极低频率的编辑事件和罕见非预期突变；（2）复杂编辑解析能力——专门优化的算法能够准确区分和量化多种编辑类型（精确编辑、部分编辑、复杂编辑等）；（3）编辑纯度评估——精确计算预期编辑占总编辑事件的比例，评估Prime Editing系统的精确性；（4）高通量处理——支持单次实验同时检测数百个样本和多个靶点，适用于大规模候选评估和质量控制。
图2 PE编辑效率检测流程示意图
3. PE先导编辑效率检测技术创新与优势
3.1 核心技术创新
3.1.1 Prime Editing特异性引物设计策略
针对Prime Editing的复杂编辑机制，开发了专门的引物设计策略：
（1）扩增区域完整覆盖pegRNA的RT template编码区域以及潜在的插入/删除边界，确保所有可能的编辑产物均能被完整捕获；
（2）引物位置避开可能受编辑影响的区域，防止因靶点突变导致扩增失败或偏倚；
（3）优化扩增子长度（通常150-280bp），兼顾双端测序的reads重叠覆盖和完整编辑信息获取；
（4）采用高保真聚合酶和优化PCR条件，最大限度减少扩增引入的人工突变。
3.1.2 Prime Editing特异性生物信息学分析
开发专门针对Prime Editing编辑模式的分析算法：
（1）精确识别预期编辑：将reads与设计的编辑序列（基于RT template）进行精确比对，定量计算完全匹配预期编辑的频率；
（2）分类统计非预期突变：系统检测并分类所有偏离预期的编辑产物，包括非预期Indel、非预期碱基替换、部分编辑（编辑不完全）、复杂编辑（多种突变组合）等；
（3）编辑纯度分析：计算预期编辑/（预期编辑+非预期突变）比值，评估Prime Editing系统的精确性；
（4）编辑产物序列特征分析：对高频非预期突变进行序列模式分析，识别可能与逆转录错误、模板跳跃或DNA修复相关的突变特征；
（5）提供编辑模式可视化热图，直观呈现Prime Editing结果的全貌。
3.2 方法学验证与性能指标
舒桐科技已完成全面系统的方法学验证，技术性能指标如下：
验证参数 | 验证结果 |
准确性 | 在0.001% ~50%浓度梯度下，阳性标准品检出率达100% |
精密度 | 在 0.01~50%浓度梯度下，扩增子三次重复实验的变异系数均在合理阈值下，说明该方法具有较好的重复性 |
灵敏度 | 能准确检测浓度低至0.01%的阳性标准品，且呈现良好的重复性和线性趋势，因此 0.01%是该方法的最低定量限（LLOQ） |
特异性 | >99.5%（阴性对照背景突变率<0.05%） |
4. 应用场景与服务优势
4.1 应用场景
Prime Editing编辑效率检测技术在基因编辑治疗产品研发与监管全流程中具有广泛应用：
（1）Prime Editor变体筛选：对比评估不同PE版本（PE1、PE2、PE3、PE4、PE5等）和改进型逆转录酶的编辑效率和精确性，指导最优编辑系统选择；
（2）pegRNA设计优化：系统评价不同RT template长度、PBS长度、nick位置对编辑效率和精确性的影响，筛选最佳pegRNA设计参数；
（3）编辑条件优化：评估递送方式（AAV、LNP、RNP等）、细胞类型、培养条件对编辑效率的影响，优化工艺条件；
（4）质量控制与批次放行：在细胞治疗产品生产过程中，检测编辑效率及非预期产物占比，确保产品质量一致性；
（5）IND申报支持：提供符合监管要求的在靶编辑数据和方法学验证报告，支持临床试验申请；
（6）临床前安全性评价：在动物模型和类器官中评估编辑效率、持久性和非预期突变发生率；
（7）临床样本监测：检测患者样本中的编辑效率和稳定性，支持临床疗效和安全性评价。
4.2 服务优势
（1）技术领先：专门针对Prime Editing复杂编辑模式优化，能够准确识别和量化各种预期及非预期编辑产物；
（2）认证质量体系：实验室同时运行ISO9001与CNAS质量管理体系，确保数据可靠性和监管可追溯性；
（3）全面方法学验证：已完成灵敏度、特异性、准确性、线性、精密度等全套验证，验证报告可直接支持IND申报；
（4）规范化报告体系：符合NMPA-CDE、FDA最新指导原则要求的分析报告，全面支持药品审评与监管检查；
（5）专家技术支持：拥有丰富基因编辑产品开发和监管申报经验的技术团队，提供从实验设计到数据解读的全流程咨询服务；
（6）成功案例积累：已为多家领先的基因治疗企业和研究机构提供Prime Editing检测服务。
5. PE先导编辑效率检测报告示例
舒桐科技提供符合监管要求的全面Prime Editing在靶分析报告，包含详细的测序数据质量评估、样本测序深度统计、比对统计等基础信息。除此之外，报告还包含以下核心内容：
（1）测序数据质量与比对统计：报告提供详细的测序数据质量评估，包括原始数据过滤后的Clean Reads数量及Clean ratio，以及双端reads拼接效率（Merge ratio）和扩增子参考序列比对效率（Align ratio），全面反映文库质量与测序数据可靠性，确保后续编辑效率分析基于高质量数据。
图3 拼接及比对情况统计表（示例）
（2）基因编辑效率定量分析：基于CRISPResso2软件，将测序reads与参考序列比对后，统计实验组与对照组中发生编辑的序列数目（Modified read counts）及编辑效率（Modified rate）。报告同时输出过滤前（Raw）与过滤后（Filtered）两套编辑效率数据，通过实验组与对照组差值扣除背景噪音，精准量化在靶编辑效率。
图4 基因编辑效率统计表（示例）
（3）编辑事件分类统计：对所有检测到的编辑事件按突变类型进行精细分型，分别统计单独发生的插入（Only Ins）、缺失（Only Del）、替换（Only Sub）及各类复合编辑事件的频率，并汇总InDel率。该分析可全面表征PE编辑产生的预期精确替换及各类非预期突变产物的分布，为编辑特异性评估提供数据支撑。
图5 编辑分类统计表（示例）
（4）编辑产物序列可视化：以单碱基分辨率展示编辑位点区域内所有高频编辑事件（占比>0.2%）的序列变化全貌。图中第一行为未经编辑的参考扩增序列，第二行起为检测到的各类编辑序列；以颜色区分四种碱基，粗体标记替换、矩形框标记插入、虚线标记缺失，垂直虚线标注预测切割位点。图右侧依次展示实验组reads占比、实验组reads数、对照组reads占比及对照组reads数，直观呈现各编辑事件的发生频率及其在实验组与对照组间的差异，为编辑模式解析与特异性评估提供序列层面的直接依据。
图6 编辑产物可视化图（示例）
6. PE先导编辑效率检测服务内容
服务流程 | 服务内容 |
项目咨询与评估 | 根据客户的Prime Editing策略（pegRNA设计、编辑类型等），提供引物设计、扩增子优化、测序策略等建议 |
样本接收与质检 | 严格按标准对样本进行全面质检，确保符合建库要求 |
靶向扩增 | 采用高保真酶进行靶区扩增 |
文库构建与质检 | 构建MGI双端测序文库，进行文库质量和浓度检测 |
高深度测序 | MGI2000平台PE150测序，保证有效深度≥1,000,000× |
生物信息学分析 | 预期编辑定量、编辑产物分类、编辑纯度计算、非预期突变分析、序列特征解析 |
数据可视化 | 编辑效率热图、质控参数汇总表 |
专业报告交付 | 提供标准化分析报告，含技术解读与咨询服务 |
IND申报支持 | 可按客户需求提供符合ICH Q2（R1）和FDA要求的方法学验证报告 |
7. 样本要求
类别 | 具体要求 |
DNA样本标准 | ·总量：待检测的DNA样本Qubit定量大于等于200ng/位点； ·浓度：大于等于20ng/μL； ·纯度：OD260/280=1.8~2.0； ·完整性：无降解（需提供凝胶电泳检测图） |
客户需同时提供样本信息 | ·样本类型及名称； ·需提供完整的编辑信息，包括pegRNA序列（spacer、PBS、RT template）、nicking sgRNA序列（如有）、预期编辑类型（替换/插入/删除）、参考基因组等 |
增值服务 | ·个性化分析（根据项目需求定制）； ·监管申报技术支持 |
*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送组织或细胞渣样本用于DNA提取，组织要求重量>50mg，细胞渣要求>2×10^7/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。
8. 参考文献
[1] Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149–157.
[2] Chen， P. J.， et al. （2021）. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell， 184（22）， 5635-5652.
[3] Nelson， J. W.， et al. （2022）. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nature Biotechnology， 40（3）， 402-410.
[4] 国家药品监督管理局药品审评中心. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2022-05.
[5] 国家药品监督管理局药品审评中心. 体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2022-05.
[6] 国家药品监督管理局药品审评中心. 基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2021-11.
[7] U.S. Food and Drug Administration. Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing: Guidance for Industry [EB/OL]. Silver Spring, MD: FDA, January 2024.