CRISPR编辑效率检测

1. 背景介绍

CRISPR-Cas系统通过向导RNA（gRNA）引导Cas核酸酶（包括Cas9、Cas12等）在目标基因组位点产生DNA断裂，利用细胞内源修复机制实现基因编辑。其中，NHEJ途径主要产生小片段Indel突变，可用于基因敲除；HDR途径可实现精确序列替换或基因插入；此外，编辑过程中还可能伴随大片段缺失、染色体倒位或易位等复杂基因组重排事件。不同Cas蛋白在切割方式、PAM识别及编辑产物谱上各有特点，但均可能产生多样化的在靶及非预期编辑产物，需进行全面精准的检测与量化。

CRISPR技术目前已在临床转化方面取得显著进展。截至2025年底，全球首款基于CRISPR的基因疗法Casgevy（exa-cel）由Vertex与CRISPR Therapeutics联合开发，用于治疗镰状细胞病和输血依赖型β-地中海贫血，已在美国、英国、欧盟等多个国家和地区获批上市。此外，超过150项CRISPR相关临床试验正在全球范围内开展，涵盖血液系统疾病、遗传性失明、癌症免疫治疗等多个领域，标志着CRISPR技术已进入商业化加速发展阶段。

随着基因编辑技术的持续演进，近年来，全球范围内的监管机构，包括美国食品药品监督管理局（FDA）和中国国家药品监督管理局（NMPA）下属的药品审评中心（CDE），均对基因编辑产品的安全性，特别是脱靶效应、染色体结构变异、载体整合风险以及编辑工具残留等问题，提出了全面而严格的评估要求[1-4]。美国FDA于2024年1月发布的指导原则《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》中明确要求基因编辑产品须开展全面的脱靶风险评估，强调应综合运用生物信息学、生化及细胞水平等多种方法进行全基因组范围分析，并对染色体完整性、克隆扩增风险及编辑产物的生物学效应进行系统评价（图1）。

图1 FDA《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》对基因编辑产品安全性评估的核心要求

针对CRISPR基因编辑产品研发和监管评价的实际需求，传统PCR结合Sanger测序的检测方法因灵敏度有限（检出限约10%–20%）、通量低，无法全面捕获CRISPR编辑后的多样化编辑产物，难以满足当前精准评估要求。舒桐科技开发了专业化的CRISPR编辑效率检测技术平台，基于高通量二代测序（NGS）技术，针对编辑靶点上下游设计特异性引物进行高深度扩增测序，能够高灵敏度、高准确性地检测和量化在靶位点的各类编辑产物，为CRISPR产品的质量控制和安全性评价提供可靠的解决方案。

2. CRISPR编辑效率检测原理

CRISPR编辑效率检测技术基于新一代测序（NGS）的高通量、高灵敏度和单碱基分辨率能力，结合针对CRISPR编辑机制优化的实验流程和专业化生物信息学分析管线。该技术通过特异性扩增包含CRISPR切割位点及其侧翼序列的基因组区域（通常150-300bp），利用超深度测序（≥1,000,000×）和高级序列分析算法，实现对在靶位点编辑产物的精确识别和定量。

检测流程包括：首先根据sgRNA靶序列和切割位点设计高特异性扩增引物，确保完整覆盖切割位点及侧翼区域；随后采用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，最大限度减少人工引入的突变；进行文库构建和超深度双端测序（PE150），确保每个位点获得≥1,000,000条有效reads，从而能够检测到低至0.1%频率的编辑事件；最后应用专门开发的CRISPR编辑分析算法，对各类编辑产物进行精确检测和定量（包含插入、缺失与替换）。

相比传统检测方法，该技术平台具有五大核心优势：（1）超高灵敏度——检测限达0.1%，能够发现极低频率的编辑事件和罕见Indel类型；（2）全面编辑产物谱分析——系统检测和量化所有类型编辑产物，包括各种长度和类型的Indel、复杂突变等；（3）高精度定量——通过超深度测序技术，准确量化各类编辑产物的相对丰度；（4）编辑效率评估——精确计算基因敲除效率、精确插入/替换占比等关键指标；（5）高通量能力——支持单次实验同时检测数百个样本和多个靶点，适用于大规模筛选和质量控制。

图2 CRISPR-Cas9基因编辑效率检测流程示意图

3. CRISPR编辑效率检测技术创新与优势

3.1 核心技术创新

3.1.1 CRISPR特异性引物设计策略

针对Cas核酸酶切割特点，开发了专门的引物设计策略：

（1）扩增区域完整覆盖切割位点及其上下游侧翼序列，确保能够完整捕获切割位点产生的各种Indel突变；

（2）引物位置避开潜在的编辑影响区域，防止因靶点突变导致扩增失败或PCR偏倚；

（4）优化扩增子长度（通常150-280bp），在保证双端测序reads完全覆盖切割位点的同时，能够检测到中等长度的片段缺失事件。

3.1.2 超深度测序

建立严格的测序深度和去重质控体系：

（1）有效测序深度≥1,000,000×，确保低至0.1%频率的编辑事件能够被统计学可靠检出；

（4）阴性对照（未编辑样本）验证背景突变水平。

3.1.3 CRISPR特异性生物信息学分析

开发专门针对CRISPR编辑模式的分析算法和评估指标：

（1）精确识别Cas核酸酶切割位点：基于sgRNA序列和PAM位置，准确定位预期切割位点；

（2）全面Indel分析：系统检测和分类所有插入和缺失突变，包括突变类型（插入/缺失）、突变长度（1bp至数百bp）、突变位置相对于切割位点的距离、突变序列特征等；

（3）编辑效率指标计算：计算总编辑效率（非野生型序列占比）、精确插入/缺失/替换占比等多个关键评估指标；

（4）复杂突变检测：识别复杂编辑事件，如同一序列同时包含插入和缺失、多位点突变等；

（5）可视化展示：提供编辑模式可视化热图，直观呈现编辑产物事件全貌。

3.2 方法学验证与性能指标

舒桐科技已完成全面系统的方法学验证，技术性能指标如下：

4. 应用场景与服务优势

4.1 应用场景

CRISPR编辑效率检测技术在基因编辑治疗产品研发与监管全流程中具有广泛应用：

（1）sgRNA筛选与优化：系统评价候选sgRNA的在靶编辑效率和Indel分布模式，筛选出编辑效率高、移码突变比例高的最佳sgRNA；

（2）递送系统评估：对比评估不同递送方式（AAV、LNP、RNP电穿孔等）对编辑效率的影响，优化递送条件；

（3）细胞产品质量控制：在CAR-T、TCR-T等细胞治疗产品生产过程中，检测关键基因（如TRAC、B2M、PD-1等）的编辑效率，确保产品质量一致性和批次放行标准；

（4）IND申报支持：提供符合监管要求的在靶编辑效率数据和完整的方法学验证报告，支持临床试验申请；

（5）临床前安全性评价：在动物模型、类器官或原代细胞中评估编辑效率、编辑产物分布和持久性，为临床风险评估提供数据支持；

（6）临床样本监测：检测患者样本中的在靶编辑效率和编辑产物稳定性，支持临床疗效和安全性评价；

（7）多重基因编辑评估：对于涉及多个靶点同时编辑的复杂策略（如CAR-T中的TRAC+B2M双敲除），同时检测多个靶点的编辑效率。

4.2 服务优势

（1）技术领先：专门针对CRISPR编辑机制优化，能够全面、准确地检测和量化各种在靶编辑产物；

（2）认证质量体系：实验室同时运行ISO9001与CNAS质量管理体系，确保数据可靠性和监管可追溯性；

（3）全面方法学验证：已完成灵敏度、特异性、准确性、线性、精密度等全套验证，验证报告可直接支持IND申报；

（4）规范化报告体系：符合NMPA-CDE、FDA最新指导原则要求的分析报告，全面支持药品审评与监管检查；

（5）专家技术支持：拥有丰富基因编辑产品开发和监管申报经验的技术团队，提供从实验设计到数据解读的全流程咨询服务；

（6）成功案例积累：已为数十家领先的基因治疗企业和研究机构提供CRISPR检测服务，支持多个IND申报项目成功获批。

5. CRISPR编辑效率检测报告示例

舒桐科技提供符合监管要求的全面CRISPR在靶分析报告，包含详细的测序数据质量评估、比对率分析等基础信息。除此之外，报告还包含以下核心内容：

（1）测序数据质量与比对统计：报告提供详细的测序数据质量评估，包括原始数据过滤后的Clean Reads数量及Clean ratio，以及双端reads拼接效率（Merge ratio）和扩增子参考序列比对效率（Align ratio），全面反映文库质量与测序数据可靠性，确保后续编辑效率分析基于高质量数据。

图3 拼接及比对情况统计表（示例）

（2）基因编辑效率定量分析：基于CRISPResso2软件，将测序reads与参考序列比对后，统计各样本中发生编辑的序列数目（Modified read counts）及编辑效率（Modified rate）。通过实验组与对照组差值扣除背景噪音，精准量化CRISPR在靶位点的实际编辑效率，为编辑工具活性评估及样本间标准化比较提供可靠数据依据。

图4 基因编辑效率统计表（示例）

（3）编辑事件分类统计：对所有检测到的编辑事件按突变类型进行精细分型，分别统计单独发生的插入（Only Ins）、缺失（Only Del）、替换（Only Sub）及各类复合编辑事件的频率，并汇总InDel率。针对CRISPR-Cas系统DSB修复的特点，该分析可全面表征NHEJ途径产生的Indel突变谱及各类非预期编辑产物的分布，为编辑工具特异性评估与产品质量控制提供精细化数据支撑。

图5 编辑分类统计表（示例）

（4）编辑产物序列可视化：以单碱基分辨率展示编辑位点区域内所有高频编辑事件（占比>0.2%）的序列变化全貌。图中第一行为未经编辑的参考扩增序列，第二行起为检测到的各类编辑序列；以颜色区分四种碱基，粗体标记替换、矩形框标记插入、虚线标记缺失，垂直虚线标注sgRNA预测切割位点。图右侧依次展示各编辑序列的reads占比及reads数，直观呈现切割位点周围Indel分布模式与编辑产物多样性，为编辑工具切割活性解析与脱靶风险评估提供序列层面的直接依据。

图6 编辑产物可视化图（示例）

6. CRISPR编辑效率检测服务内容

7. 样本要求

*注：①所有样本必须符合上述质量标准，以确保检测结果的准确性和可靠性；②客户也可以寄送组织或细胞渣样本用于DNA提取，组织要求重量>50mg，细胞渣要求>2×10^7/位点；③对于特殊样本类型，请提前与舒桐技术团队沟通（电话 15336557985；产品订购/技术支持 service@generulor.com）。

8. 参考文献

[1] 国家药品监督管理局药品审评中心. 体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2022-05.

[2] 国家药品监督管理局药品审评中心. 体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2022-05.

[3] 国家药品监督管理局药品审评中心. 基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）[EB/OL]. 北京: 国家药品监督管理局药品审评中心, 2021-11.

[4] U.S. Food and Drug Administration. Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing: Guidance for Industry [EB/OL]. Silver Spring, MD: FDA, January 2024.

[5] Jinek， M.， et al. （2012）. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science， 337（6096）， 816-821.

[6] Cong， L.， et al. （2013）. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science， 339（6121）， 819-823.

[7] Zetsche, B., et al. (2015). Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 163(3), 759–771.

[8] Frangoul， H.， et al. （2021）. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine， 384（3）， 252-260.